Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Манк М. -> "Биология развития млекопитающих " -> 67

Биология развития млекопитающих - Манк М.

Манк М. Биология развития млекопитающих — М.: Мир, 1990. — 406 c.
ISBN 5-03-001333-4
Скачать (прямая ссылка): biologiyarazvitiyamlekopitaushih1990.djvu
Предыдущая << 1 .. 61 62 63 64 65 66 < 67 > 68 69 70 71 72 73 .. 162 >> Следующая

выполните следующие процедуры.
11. Приготовьте разведения конъюгата первого антитела в PBS, содержащем
10%-ную мышиную сыворотку. Нанесите по 100 мкл разбавленного конъюгата на
каждое стекло (нлн больше, если на стекле несколько больших срезов). Если
срезы маленькие, а конъюгата в вашем распо ряжеини не очень много, можно
сократить покрываемую площадь, очертив ее тушью. Всякий раз внимательно
осматривайте пробирку с конъюгатом: на дне его обычно можно видеть
небольшой осадок, но если его количество заметно увеличилось - это может
служить признаком деградации конъюгата. Агрегация конъюгата может вызвать
образование фона (см. "Помехи н их устранение", табл. 6.6).
12. Удалите со стекол PBS с мышиной сывороткой п осторожно промокните
жидкость бумагой, прикасаясь к поверхности стекла, где не срезов. Это
делается для того, чтобы не произошло разбавление конъюгата, который
вскоре предстоит нанести. Не давайте стеклам высохнуть - осушайте их
партиями (не более 2-3) и немедленно наносите иа поверхность срезов
конъюгат (с помощью пипетки). Убедитесь в том, что он распреде-
11
Продолжение табл. 6.5
лился равномерно. Будьте внимательны, и, промакпвая стекла, не смажьте
срезы. Инкубируйте в лотке под опущенной крышкой в течение 1 ч прн
комнатной температуре; количество жидкости должно быть достаточным для
поддержания влажной атмосферы.
13. Тем временем приготовьте разбавления конъюгата второго антитела в
PBS+10%-ная мышиная сыворотка, как было указано выше. Если это
пероксидазный конъюгат, все разбавленные растворы не должны содержать
азида, который ингибирует пероксидазу.
14. Удалите со стекол конъюгат первого антитела и промойте PBS + БСА.
Осушите и промойте стекла снова; повторите с каждым стеклом цикл трижды.
15. Промокните и нанесите второй (пероксидазный) конъюгат, как указано
выше. Инкубируйте 1 ч.
16. Осушите стекла и промойте PBS. Повторите цикл четырежды. Соберите
стекла в штатив для окрашивания, погрузив его в контейнер, содержащий 200
мл 0,15 М трис с pH 7,6, такой же контейнер будет использован для
субстрата ДАБ при пероксндазном окрашивании.
17. Приготовьте субстрат ДАБ для пероксидазного окрашивания. (Замечание:
все операции с участием ДАБ должны проводиться в перчатках н под тягой.)
Взвесьте 100 мг ДАБ. Поместите навеску в коническую пробирку н добавьте
200 мл 0,15 М трис pH 7,6, 400 мкл концентрированной перекиси водорода
(храните при 4°С н обновляйте через несколько месяцев). Осторожно
покачайте пробирку до растворения. Если нужно, добавьте NiCl2 (замечания
относительно выбора субстрата см. в тексте). Вылейте в сосуд, в котором
будет проводиться окрашивание, и перенесите туда из трис-буфера штатив со
стеклами. Окрашивайте в течение 5 мин при комнатной температуре, затем
перенесите штатив со стеклами обратно- в контейнер с трнс-буфером.
Вылейте раствор субстрата ДАБ и тщательно вымойте сосуд для окрашивания и
остальную посуду. Промойте стекла в трех порциях дистиллированной воды и
возвратите их в лоток для окрашивания, чтобы провести реакцию на щелочную
фос-фатазу.
18. Промойте стекла вероиал-ацетатным буфером с pH 9,2 (ВАБ) (но не PBS,
так как фосфат ингибирует реакцию кислой фосфатазы) н оставьте их. Тем
временем приготовьте раствор субстрата щелочной фосфатазы. Взвесьте 5 мг
Brentamine Fast Red TR (Sigma) н поместите навеску в маленькую сухую
стеклянную пробирку. 5 мг натриевой соли нафтола As-BI (Sigma) внесите в
универсальный пластиковый контейнер (объемом на 20 мл) н добавьте 10 мл
ВАБ, осторожно встряхните. Растворите Fast Red TR в трех каплях
диметнлформамида (храните защищенным от света) и прибавьте к ВАБ/иафтол
AS-BI. Остатки Fast Red TR из пробирки смойте раствором ВАБ. Прибавьте
200 мл левамизола (50 мМ маточного раствора) (конечная концентрация
левамнзола 1 мМ) для ингибирования эндогенной щелочной фосфатазы.
Профильтруйте этот субстрат через бумагу Whatman № 1 в стеклянной воронке
н немедленно используйте.
19. Осушите стекла, промокнув ВАБ, и залейте раствором субстрата.
Инкубируйте в течение 1 ч прн комнатной температуре. Интенсивность
окраски можно усилить, добавляя свежий субстрат с интервалами в 20 мни.
20. Промокните стекла, промойте несколько раз PBS или дистиллированной
водой, окрасьте гемалумом (слабо, если красный и коричневый цвета
предполагается демонстрировать иа черно-белых фотографиях) и заключите в
водную среду. Замечание: продукт реакции щелочной фосфатазы растворяется
в спирте.
') Для окрашивания остальных препаратов делайте те же процедуры, но
блокируйте эндогенную пероксидазу в течение 30 мин н точно выполняйте все
указанные промы
вання.
!) См. ссылки П5) н [301.
Методы маркнровання клеток н нх прнмененне
165
саторам, лучший режим приходится искать методом проб и ошибок. Мы пришли
к выводу о необходимости криостатных срезов нефиксированной ткани;
полученные срезы подвергают щадящей фиксации в разбавленных белковых
фиксаторах (например, параформальдегид - лизин - периодит, табл. 6.5, п.
Предыдущая << 1 .. 61 62 63 64 65 66 < 67 > 68 69 70 71 72 73 .. 162 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed