Биология развития млекопитающих - Манк М.
ISBN 5-03-001333-4
Скачать (прямая ссылка):
(May and Baker), разведенном дистиллированной водой 1:4 с добавленным
отвердителем (Ilford). Промывайте стекла в слабой струе воды в течение 1
ч в темноте, сполосните дистиллированной водой и высушивайте на воздухе,
оставив их в вертикальном положении. Если оборотная сторона стекол не
была вытерта при их извлечении из эмульсии, это можно сделать сейчас или
после окрашивания.
28. Стекла, предварительно окрашенные G-методом, опустите в 2-4%-ный
раствор Гимза в буфере с pH 6,8. Контролируйте интенсивность окраски на
мокрых стеклах. Если она удовлетворительная, сполосните в буфере и сушите
на воздухе, установив в почти вертикальном положении. Локализуйте
предварительно сфотографированные митотические клетки и сравните нх с
фотографическими отпечатками после G-окраски. Если они окажутся
информативными, сфотографируйте снова. Если стекла предварительно не были
окрашены, попытайтесть сделать это после гибридизации, используя
краситель Райта [22].
10*
148
Глава 5
__________.________________________________________________Продолжение
табл. 5.8
29. Защищайте стекла с дифференциальным окрашиванием от прямого света в
процессе работы и после высушивания. Окрашивайте высушенные стекла в
Hoechst 33258 (Sigma) (10 мкг/мл в 2XSSC) в течение 30 мни так, чтобы под
покровным стеклом был избыток красителя. Смойте покровные стекла 2XSSC,
положите стекла горизонтально в 2XSSC (в плоскую пластиковую кювету) и,
не закрывая, экспонируйте в течение 1 ч иа расстоянии 15 см от источника
длинноволнового ультрафиолетового света (Sylva-nia). Сполосните стекла
буфером pH 6,8 и окрашивайте в 5- 10%-ном растворе Гимза в буфере. Под
микроскопом на мокрых стеклах контролируйте появление дифференциальной
окраски, промойте в буфере и сушите на воздухе в вертикальном положении.
Поскольку современные иммерсионные масла могут обесцвечивать хромосомы,
рекомендуется делать постоянные препараты, заключив их под покровным
стеклом в такие среды, как DePex или Eukitt.
30. Если проявленные препараты удовлетворительны с точки зрения гнбрн-
дизацнонного сигнала н фона, проявляйте следующие. Если их качество
неудовлетворительно, их можно оставить для дальнейшей экспозиции. Важно
помнить прн этом, что дальнейшая экспозиция часто приводит к повышению
фона. Колебания в количестве зерен серебра и времени экспозиции описаны
[25].
') См. также работы [27-2&].
БУДРа [20]. Для мыши соответствующая методика только начинает
разрабатываться. Поскольку процедура требует прохождения клетками раунда
репликации в присутствии БУДРа, она может быть осуществлена только на
культивируемых клетках. Предложены многочисленные методики инициации
культуры эмбриональных фибробластов [21]. С их помощью исследователь
может получить целый ряд стекол с большим количеством митотических
клеток, которые могут быть использованы для нескольких различных зондов.
Вместе с тем инициация культуры на основе общего клеточного пула
нескольких эмбрионов имеет и отрицательную сторону, связанную с
отсутствием сведений об источнике клеточной линии. Кроме того, эта
процедура требует большой затраты времени.
6.2. Методы пред- и постокрашивания
Альтернативные способы идентификации хромосом на препаратах заключаются в
"предокрашивании" или "постокрашивании" (после гибридизации).
Предокрашивание может быть выполнено в соответствии с процедурой,
описанной нами выше (табл. 5.6). Оно не сохраняется после гибридизации in
situ. Поэтому митотические клетки необходимо сфотографировать,
локализовать их на препарате при помощи верньерного стекла или стекла с
сеткой и снова сфотографировать (после гибридизации) для сравнения
рисунка расположения сегментов и зерен серебра.
Карнотипироваиие гамет, эмбрионов и плодов
149
Поскольку цели многих исследований предполагают фотографирование по
меньшей мере 50 клеток, процедуру предокра-шивания следует признать
весьма трудоемкой. Для постокрашивания после гибридизации используют
краситель Райта (Gurr или Merck) [22]. Довольно ч^сто этот метод не дает
желаемых результатов: сегментная дифференцировка при этом не выявляется
четко. Для пред- и постокрашивания не нужно культивирование клеток, так
как адекватное число митотических клеток может быть получено прямо из
плодов средних стадий развития (табл. 5.3,Б).
Итак, репликационное окрашивание хромосом эмбриональных фибробластов
наиболее эффективно для локализации уникальных последовательностей в
немеченом мышином геноме. Этот метод представлен в табл. 5.8 и на рис.
5.7,Л. Процедуры пред- и постокрашивания также упоминаются в табл. 5.8
(см. также рис. 5.7,Б). Использование неравной реципрокной транслокации
для маркирования района хромосомы проиллюстрировано на рис. 5.7, Б.
6.3. Оценка метки
Процедура анализа результатов определяется природой исследования. Если
локализация последовательности (последовательностей) совершенно не
известна и требует точного картирования G-сегмента (репликационные
сегменты эквивалентны) на хромосоме, возникает необходимость
