Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Манк М. -> "Биология развития млекопитающих " -> 59

Биология развития млекопитающих - Манк М.

Манк М. Биология развития млекопитающих — М.: Мир, 1990. — 406 c.
ISBN 5-03-001333-4
Скачать (прямая ссылка): biologiyarazvitiyamlekopitaushih1990.djvu
Предыдущая << 1 .. 53 54 55 56 57 58 < 59 > 60 61 62 63 64 65 .. 162 >> Следующая

10, разд. 2), растворенной в 300 мкл гибридизационного буфера, состоящего
нз 50%-ного формамнда, х5 раствора Денхардта, х5 SSPE pH 7,2 (0,9 М
хлорида натрия/50 мМ однозамещенного фосфата натрия/5 мМ ЭДТА), 10%-ного
сульфата декстрана н 200 мкг/мл ДНК спер-миев лосося (Sigma). Сульфат
декстрана растворяется с трудом, его рекомендуется нагревать в кипящей
воде н сильно встряхивать.
15. Перед использованием гибрнднзацнонную смесь с зондом денатурируйте
кипячением в течение 2-3 мни, а затем погрузите в лед. Воспользуйтесь
закрытой пробиркой Эппендорфа, проколотой инъекционной иглой (21
калибра), за которую можно держать пробирку в кипящей воде.
16. Пипеткой нанесите иа каждое предметное стекло по 30 мкл гибридиза-
цнонной смесн. Этот объем примерно соответствует трем каплям. Их надо
расположить на равном расстояннн друг от друга, а затем осторожно
опустить на ннх покровное стекло (размером 64x22 мм) так, чтобы под ним
не образовались пузырьки воздуха. Края покровного стекла ограничьте
раствором резины (Weldtite) и поместите стекла во влажную камеру при 42
°С на ночь. Для этого стекла, укрепленные в стеклянном штативе, помещают
в плотно закрытые пластиковые коробки для сэндвичей (Steward) над
увлажняющим раствором 2xSSC.
17. Снимите раствор резины пинцетом н осторожно удалите покровные стекла
в 5XSSC (0,75 М хлорида натрия/0,075 М трехзамещенного цитрата натрия),
погрузив в него стекло и покачивая. Промывайте в 2XSSC при комнатной
температуре в течение 1-2 ч.
18. Строгость, с которой следует относиться к последующей процедуре
промывания, зависит от типа использованного зонда; предлагаемые нами
рекомендации служат лишь общим руководством и могут быть изменены.
19. В случае уникальных последовательностей промойте стекла в 2xSSC прн
65°С в течение 1 ч с одной сменой горячего 2XSSC. Затем один раз промойте
в 0.2XSSC прн комнатной температуре в течение 30 мин и одни раз в 0.1XSSC
при той же температуре н то же время.
20. В случае повторяющихся последовательностей промывайте в (0,5-0,1) X
XSSC прн 60 °С в течение 1 ч с одной сменой горячего SSC. Затем промойте
в O.lxSSC прн комнатной температуре.
21. После промывания обезводьте препараты в серии спиртов и храните в
эксикаторе.
Продолжение табл. 5.8
22. Приготовьте эмульсию для погружения стекол. Радиоавтографии посвящены
многочисленные детальные обзоры (например, [25]), ниже приводится краткий
перечень процедур с использованием Ilford Nuclear Emulsion L4. Эмульсия
поступает в пузырьках из темного стекла объемом по 50 мл и имеет
полужидкую консистенцию. Храните ее при 4°С, вдали от радиоактивных
материалов. В темной комнате при красном свете (Kodak № 6В) разделите
эмульсию примерно пополам, одну половину уберите в темное место для
использования в будущем, а другую растворяйте в течение 30 мии в 25 мл
дистиллированной воды в водяной бане при 55 °С. Растворять можно в 50-мл
пластиковой центрифужной пробирке (Nunc), она может быть использована и в
качестве контейнера для погружения стекол. Перед погружением стекол
тщательно размешайте смесь при помощи предметного стекла, удерживаемого
пластиковым пинцетом (металлическими инструментами пользоваться нельзя,
они могут дать зерна фона).
23. Медленно погружайте стекла; извлекая, вытирайте бумагой нижнюю
сторону каждого и устанавливайте их для высушивания в почти вертикальном
положении. Оставьте на 30 мии. Разбавленной эмульсией можио пользоваться
3-4 раза, если хранить ее в защищенной от света посуде при 4 °С, прн этом
не теряется ее чувствительность н не увеличивается фон.
24. Поместите стекла в светонепроницаемые коробки для препаратов с
осушителем, заклейте коробки черной пластиковой лентой и храните для
экспозиции при 4 °С.
25. Учитывая вероятность появления технических проблем в ходе
последующего анализа, целесообразно обеспечить себя контрольными
стеклами. Контроль должен включать препарат из предшествующего удачного
эксперимента с зондированием в качестве положительного контроля, стекло,
приготовленное в процессе текущего эксперимента, но без зонда (в качестве
отрицательного контроля), а также пустое стекло для определения фона
эмульсии.
26. Время экспозиции зависит от нескольких факторов, в частности от
природы последовательности и активности зонда. Повторяющиеся
последовательности с зондом высокой активности требуют короткой
экспозиции; уникальные последовательности и низкая активность
предполагают более длительную экспозицию. Для 1251 оно должно составлять
от 2 до 9 дней, для 3Н- 10-30 дней. Чтобы определить время экспозиции,
используйте худшие стекла, например с небольшим числом метафаз; если они
были предварительно окрашены G-методом, возьмите те, с которых сделано
наименьшее число фотографий.
27. Нагревайте стекла до комнатной температуры в течение 1 ч, проявляйте
в полной темноте в D19 (Kodak) при 20 °С в течение 5 мин без движения
жидкости. Сполосните их в 1%-иой уксусной кислоте и фиксируйте в Amfix
Предыдущая << 1 .. 53 54 55 56 57 58 < 59 > 60 61 62 63 64 65 .. 162 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed