Биология развития млекопитающих - Манк М.
ISBN 5-03-001333-4
Скачать (прямая ссылка):
Таблица 5.8. Гибридизация хромосом in situ1"
Предлагаемый нами метод представляет собой видоизменение методики,
описанной для человека [24].
1. Возьмите порцию третьей субкультуры мышиных эмбриональных фнбро-
бластов в фазе роста [21], добавьте БУДР (Sigma) в концентрации 200
мкг/мл и продолжайте культивировать в течение 16 ч. Наличие БУДРа в среде
обеспечивает блокирование и синхронизацию многих клеток в середине S-
фазы. Защищайте культуру клеток, клеточную суспензию и препараты клеток
на стеклах от света во избежание спонтанных разрывов ДНК. Простой способ
предохранения от света - завернуть все контейнеры в алюминиевую фольгу.
2. Спустя 16 ч промойте клетки средой четыре раза для полного удаления
БУДРа. Инкубируйте в свежей среде, содержащей 10 мкМ тимидина, и соберите
клетки через 6-6,5 ч.
3. Сбор клеток. Уменьшите объем жидкости до 10 мл. Отделите митотические
клетки, энергично постукивая флаконом о ладонь.
4. Если этот прием не дал результата, воспользуйтесь 0,25%-ным раствором
трипсина в PBS. Удалите среду, осторожно налейте 10 мл раствора трипсина
и в течение минуты осторожно покачивайте жидкость над клетками, чтобы
ослабить их прикрепление, затем быстро вылейте трипсин, заменив его
средой. Легкое постукивание по флакону освободит митотические клетки.
5. Отцентрнфугируйте клеточную суспензию при 200 g в течение 5 мии.
Удалите иадосадочиую жидкость и ресуспендируйте клеточный сгусток в
0,56%-ном водном растворе хлористого калия. Оставьте на 8 мии при
комнатной температуре.
6. Отцентрнфугируйте при 200 g 5 мии и фиксируйте клетки; делайте
препараты, как было описано в табл. 5.3, Б. Для выявления сегментациоиио-
го рисунка хромосом рекомендуется делать препараты после того, как
суспензия клеток простоит в фиксаторе ночь прн +4°С и затем ресуспен-
дируется в свежем фиксаторе. Суспензии можно хранить в фиксаторе до 1
недели.
7. Для гибридизации in situ, начиная с этого пункта методики, все стекла
(предварительно окрашенные и предназиачеиные для постокрашнвания)
эквивалентны. В случае предокрашеииых препаратов сфотографируйте
митотические клетки (разд. 5.3) и локализуйте нх положение при помощи
верньерного стекла или стекла со шкалой. Современные иммерсионные масла
трудно полностью удалить с поверхности стекла, поэтому для
фотографирования препараты должны быть заключены под покровным стеклом в
водорастворимую заключающую среду (такую, как Hydramount, Gurr), которую
можно удалить проточной водой. Число необходимых фотографий зависит от
цели исследования. Прн картировании повторяющихся последовательностей с
помощью зоидов, меченных с высокой удельной активностью, можно обойтись
наименьшим количеством (<|50); для картирования маленьких уникальных
последовательностей зондом, меченным с низкой удельной активностью, нужно
максимальное количество (^100) фотографий. Удобно работать с 10 стеклами
одновременно и растворы готовить заранее, за исключением тех случаев,
когда требуются свежеприготовленные.
8. Перед гибридизацией in situ тщательно обесцветьте препараты в
фиксаторе (3 части метанола; 1 часть ледяной уксусной кислоты), так как
красители типа Гимза характеризуются положительной хемографичностью в
отношении ядерных эмульсий.
9. Прокипятите раствор РНКазы (Sigma) в 2XSSC (100 мкг/мл) в течение 10
мин для удаления любых примесей ДНКазы. Охладите и нанесите на каждый
препарат по 200 мкл (под покровное стекло размером 1,64x 22 мм).
Препараты поместите в камеру, увлажненную 2XSSC на 1 ч при 37 °С.
10-171
145
Продолжение табл. 5.8
Подходящие камеры можно сделать нз пластиковых коробок для сэндвичей
(Steward). Неиспользованную РНКазу можно хранить замороженной около года.
10. Снимите покровные стекла н поместите препараты в стеклянный штатив,
промойте в четырех сменах средой 2XSSC, затем обезводьте в спиртах
возрастающей крепости: 10, 50, 75, 96 и 100%. Высушите стекла на воздухе
н храните в эксикаторе. Рекомендуется держать стекла в штативах
(держателях), осторожно перенося их в таком положении через растворы, -
это уменьшит потерю клеток. Можно приобрести соответствующие наборы
(Horwell).
11. Денатурируйте ДНК на стеклах в 70%-ном формамиде н 0,1 мМ
ЭДТА
в 2xSSC при pH 7,0 в течение 4 мин прн 65 °С. Установите pH добав-
лением 5 М НС1, Промойте, сменив четыре порцнн 2XSSC, обезводьте
проводкой через серию спиртов и храните в эксикаторе.
12. Если предполагаемый зонд помечен 1251, ацетнлируйте стёкла в 0,25%-
ном уксуснокислом ангидриде в 0,1 М трнэтаноламине с pH 2 прн комнатной
температуре в течение 10 мин. Ацетнлнрованне уменьшает фон, но в нем нет
необходимости, если используется другая метка. Промойте, сменив четыре
раза 2XSSC, обезводьте в сернн спиртов н храните в эксикаторе.
13. Детали ник^грансляцнн, мечення н подсчета метки описаны в гл.
10.
Со следующего пункта пропнсн начинается работа с изотопом, напоминаем о
необходимости соблюдать технику безопасности.
14. Для 10 стекол требуется 100-150 нг ДНК зонда, меченного 32Р (см. гл.
