Биология развития млекопитающих - Манк М.
ISBN 5-03-001333-4
Скачать (прямая ссылка):
кажется короче обычной (в норме Х-хромосома представляет собой пятую'из
наиболее длинных хромосом), окрашена темнее, чем остальные. Окраска
другой Х-хромосомы, меченной Is (In7; X) 1С1, остается неизмененной.
Следует заметить, что ожидаемое увеличение длины этой маркерной хромосомы
не всегда оказывается очевидным. Однако, если бы меченой хромосомой была
неактивная X, ее можно было бы увидеть как наиболее темную и длинную
хромосому клетки. В дифференциальном окрашивании проявляется различная
реакция на раскручивание хроматина, вызываемое длительным гипотоническим
воздействием (табл. 5.7). Вывод о том, что темное окрашивание
действительно отражает неактивность, получил подтверждение в
многочисленных цитогенетических и энзимологических исследованиях.
Кариотипирование гамет, эмбрионов и плодов
143
> % *
* * *
- ¦ Ч*'-
*\ / Ш* f*% * *
V*.
1\% - 'У ¦-. *'Ж
^ -1 . . . U > ¦ * **•
•'Я ч-:С ^ Ф
% *
V'4
Рис. 5.6. А. Метафаза, в которой выявляется неактивная нормальная Х-хро-
мосома (большая стрелка) и маркированная (IslCt) активная Х-хромосома
(маленькая стрелка). Б. Интерфазное ядро клетки амниона, в котором
выявляется тельце полового хроматина (большая стрелка) и хромоцентры
(маленькие стрелки).
5.5. Окрашивание для выявления полового хроматина
Если в работе требуется определить пол эмбриона, а хромосомные препараты
неэффективны (Y-хромосома не является маркерной, а применение С-метода
нецелесообразно), самок от самцов можно отличить по наличию или
отсутствию полового хроматина. Хотя половой хроматин в ядрах мыши не
выделяется так четко, как в ядрах некоторых других видов млекопитающих,
эта структура может быть использована для определения пола; при этом
источником ядер, как правило, служит амнион [19]. Для приготовления
препаратов амнион изолируют, фиксируют в смеси метанол : ледяная уксусная
кислота (3:1) н распластывают ядра в 60%-ном водном растворе уксусной
кислоты, как описано в табл. 5.3,Л. Распластанные ядра могут быть
окрашены в уксусно-кислом орсеине (Gurr) прямо под покровным стеклом.
Если окрашивание идет медленно или если есть необходимость некоторое
время хранить препараты, покровное стекло окружают по краям специальным
изолирующим раствором (Weldite), препятствующим высыханию краски. В ядрах
женских плодов, половой хроматин выявляется в виде темноокрашенного
тельца (рис. 5.6,Б). У различных эмбрионов женского пола число хроматин-
положительных ядер варьирует между 40 и 80%. Большинство вариаций
объясняется техническими причинами, например числом ядер, у которых при
уплощении на стекле тельце оказалось в хорошо просматриваемом
144
Глава 5
положении. В этих ядрах тельце можно легко отличить от хромоцентров по
более темной окраске и расположению в небольшой "лунке" ядерной мембраны.
В ядрах некоторых мужских плодов выявляются ложные тельца полового
хроматина, в действительности представляющие собой крупные хромоцентры
периферической локализации. Число таких клеток редко достигает 10%.
6. Гибридизация хромосом
В том случае, когда целью гибридизации in situ является локализация в
геноме неизвестных уникальных последовательностей, необходимо
использовать для анализа только те ткани, которые могут обеспечить
достаточное количество препаратов с большим числом митотически делящихся
клеток. Это ограничение связано с тем, что часть материала будет потеряна
по техническим причинам, а при подсчете гранул серебра необходима
выборка, достаточная для получения статистически достоверного результата.
Другая проблема связана с трудностями идентификации индивидуальных
хромосом и выявления их структурной дифференцировки, что вынуждает
прибегнуть к некоторым дополнительным приемам окрашивания. Если
гибридизация проводится с повторяющимися последовательностями, для
которых характерен сильный гибридизационный сигнал, можно работать с
меньшим числом стекол и митотических клеток, но при этом необходимость
окрашивания остается. С другой стороны, как уникальные, так и
повторяющиеся последовательности легче локализовать, если известно, в
какой хромосоме они расположены. В этом случае задача сводится к
выявлению данной хромосомы при помощи соответствующих хромосомных
маркеров. Более того, если мы знаем приблизительное расположение
интересующих нас последовательностей на хромосоме, нужный район можно
обнаружить при наличии подходящей неравной реципрокной транслокации.
Поскольку набор транслокаций, которые могут быть использованы в качестве
маркеров, ограничен [17], мы описываем более общий подход к гибридизации
in situ (табл. 5.8), основывающийся на допущении, что предварительных
сведений о положении уникальных последовательностей нет. При наличии
таких данных процедура упрощается.
6.1. Культура эмбриональных фибробластов
и репликационная окраска
Проблема сохранения окраски в процессе гибридизации in situ для клеток
человека в значительной степени была решена с введением репликационного
G-метода и использованием
