Биология развития млекопитающих - Манк М.
ISBN 5-03-001333-4
Скачать (прямая ссылка):
7. Если контраст между С-сегмеитом и остальной хромосомой
неудовлетворителен (она окрашена слишком темно), можно предположить, что
время выдержки в 2XSSC было недостаточным. Стекла без масла могут быть
возвращены для дальнейшей проводки и повторного окрашивания. Если
контраст остается слабым, несмотря на использование более
концентрированного красителя, причина может заключаться в слишком
длительном воздействии 5М НС1 и (или) 2XSSC при 65 °С - такие препараты
уже нельзя улучшить. Это означает, что соответствующее время обработки
2XSSC нужно с самого начала сократить.
5.3. G-окрашенные препараты и их анализ
Индивидуальные хромосомы мыши, так же как и других млекопитающих, можно
идентифицировать, применяя разные методы окраски, выявляющие сегментную
дифференцировку хромосом. Наиболее эффективный из них - G-метод. С его
помощью создается стандартная идиограмма кариотипа (рис. 5.4). Один из
способов такого окрашивания описан в табл. 5.6 и иллюстрирован рис. 5.5.
На этом рисунке представлен традиционный метод анализа кариотипа,
заключающийся в расположении гомологичных хромосом парами в порядке
уменьшения их линей-
ваиие не выявляет реципрокного продукта - длинного маркера. В. Одна из
Робертсоновских или метацеитрических хромосом Rb (11.13)4Впг [17],
которая также может быть использована в качестве маркерной (указана
стрелкой). Г. Метафаза, пригодная для определения пола. Хорошо заметна
маленькая субметацентрическая Y-хромосома (указана стрелкой). Д. Y-
хромосома, фактически лишенная G-сегмента, благодаря чему резко
выделяется среди
других хромосом.
138
Глава 5
Рис. 5.4. Стандартная идиограмма G-окрашеиных хромосом мыши [26].
(Воспроизводится с любезного разрешения редактора и издателя.)
то О 'П31 >
Таблица 5.6. G-окрашивание хромосом
На свежеокрашенных препаратах сегментная диффереицнровка выражена слабо,
и несмотря на то, что описан ряд способов устранения этого недостатка,
препараты приходится выдерживать в коробках при комнатной температуре от
3 до 30 дней. Оптимального качества они обычно достигают примерно через
10 дней.
1. Выдержанные в течение достаточного времени препараты поместите в
закрытые сосуды Коплина в водный 2XSSC при 60-65°С. Оставьте на 1,5-2 ч.
Этот период времени не является критическим и может быть увеличен до 3 ч.
2. Приготовьте 0,025%-иый трипсин (Difco 1 : 250) в 0,85%-ном нормальном
солевом растворе (солевые таблетки Oxoid) при комнатной температуре.
3. Остудите сосуды Коплина со стеклами до комнатной температуры в
проточной водопроводной воде. Перенесите стекла в 0,85%-иый солевой
раствор и оставьте при комнатной температуре на 5 мии.
4. Извлеките одно стекло, уберите избыток солевого раствора,
прикоснувшись к фильтровальной бумаге, положите стекло горизонтально (т.
е. поперек двух стоящих ребром стеклянных пластинок) и поливайте из
пастеровской пипетки 0,025%-ным раствором трипсина. Время воздействия
трипсином' существенно влияет на качество препарата: недодержка приводит
к слабому разрешению сегментов, а передержка нарушает морфологию
хромосом. Чувствительность хромосом к трипсину определяется несколькими
факторами:
а) сократившиеся хромосомы более чувствительны, чем удлиненные;
б) недавно приготовленные препараты (2-7 дней тому назад) более
чувствительны, чем приготовленные раньше (за 7-30 дней);
в) "мягко фиксированные" хромосомы (оптически менее плотные под фазовым
контрастом) более чувствительны, чем "грубо" фиксированные хромосомы
(оптически плотные).
В нашей лаборатории, например, считают, что 10-дневиые препараты со
смешанной популяцией сокращенных и удлиненных "грубо" фиксированных
хромосом для удовлетворительного результата требуют обработки трипсином в
течение 20 сек. Рекомендуется сначала провести через всю процедуру
воздействия трипсином и окрашивания одно пробное стекло, затем -
остальные. Раствор трипсина остается эффективным до 2 ч с момента
приготовления.
5. После обработки дайте трипсину стечь, быстро наклонив стекло, затем
погрузите его в 0,85%-ный солевой раствор, чтобы уменьшить активность
трипсина.
6. Сполосните буферным раствором с pH 6,8 (таблетки Gurr) и перенесите в
краситель Гимза, разбавленный тем же буфером (т. е. 1-2%-ный раствор
Merck Giemsa). Просмотрите мокрое стекло под микроскопам XI28.
7. Сполосните стекла в буфере с pH 6,8, промокните избыток буфера и
высушите препарат струей воздуха из большой резиновой груши.
8. Анализируйте препарат с иммерсионным маслом. Это способствует
достижению наиболее высокого оптического разрешения.
9. Помните, что современные масла обесцвечивают (выщелачивают) краситель.
Если микроскопический анализ или фотографирование препарата не
предполагается в течение ближайших суток, рекомендуется сделать
постоянный препарат, заключив его в такую среду, как DePex или Eukitt, и
закрыть покровным стеклом.
Успех G-метода в большой степени зависит от качества растворов и чистоты
посуды. Растворы готовьте на дистиллированной в стеклянной посуде воде н
