Биология развития млекопитающих - Манк М.
ISBN 5-03-001333-4
Скачать (прямая ссылка):
метацентрических робертсоновских слияний, спонтанно возникающих в
лабораторных или диких популяциях. Примеры таких маркеров, в частности,
наиболее часто используемая Тб-хромосома, показаны на рис. 5.3,5 и В.
Идентификация Y-хромосомы после рутинного окрашивания облегчается, если
использовать линии мышей со спонтанно возникшей измененной Y-хромосомой.
Известны две такие линии, их Y-хромосомы короткие и субметацентрические
(рис. 5.3,5) [9, 10].
Кариотипироваиие гамет, эмбрионов и плодов
135
Таблица 5.4. Рутинное окрашивание хромосом
Существуют многочисленные красители для хромосом, здесь же уместно
упомянуть два нз наиболее часто употребляемых: краситель Гимза и толуи-
дииовый синий. Часто качество препаратов митотических клеток ухудшается
из-за прокрашивания цитоплазмы. Этого можно избежать, используя
предварительный гидролиз препаратов.
1. Поместите стекла в сосуд Коплииа с 5 М НС1 при комнатной температуре,
оставьте иа 5 мии. Выньте стекла и промойте в проточной водопроводной
воде, промокните лишнюю воду и окрашивайте по Гимза или толуидииовым
синим.
2. Окрашивание по Гимза
Л. Имеющиеся в продаже красители Гимза имеют различные концентрации.
Концентрированный раствор Гимза (Merck), разведенный до 1%-иого фосфатным
буфером pH 6,8 (таблетки буфера Gurr), дает удонлетворительиое
окрашивание в течение 15 мин. Для других растноров Гимза нремя окраски
контролируется под микроскопом (Х128) на нлажных препаратах, прн этом
следует иметь в виду, что митотические клетки при нысыхаиии будут более
темными.
Б. После окрашивания быстро сполосните препараты буфером pH 6,8,
промокните, прикоснувшись фильтровальной бумагой, а остатки буфера
удалите струей воздуха из резиновой груши.
В. Для получения постоянных препаратов заключите в среду иа основе
ксилола, такую, как DePex (Gurr) или Eukitt (Riedel-de Наеп), и накройте
покровным стеклом. Если препарат не предназначен для длительного
пользования, иммерсионное масло можно наносить непосредственно на стекло.
Имейте в виду, что современные иммерсионные масла могут быстро нытя-
гивать краситель.
3. Окрашивание толуидииовым синим
Толуидииовый синий дает альтернативную по отношению к Гнмза окраску. Этот
краситель можно приобрести в виде готовой для употребления заключающей
среды (ASCO). Добавьте каплю красителя под покровное стекло и осторожно
выдавите его излишки. Это даст быстрое окрашивание, интенсивность
которого не унеличится. Такие препараты можно хранить в защищенном от
света месте в течение 4-6 иед. Если препарат обесцветится, смойте
покровное стекло водой при 60 °С и окрасьте снова в свежей окрашивающей
среде для заключения.
5.2. С-окрашенные препараты и их использование для идентификации Y-
хромосомы
С-методы выявляют структурный гетерохроматин, который у мыши в норме
представлен локализованной в центромерном районе сателлитной ДНК-
Существуют межлинейные различия в количестве С-окрашенного материала у
разных аутосом [11], что используется в качестве клеточного маркера у
химер [12]. Что касается Y-хромосомы, то у всех известных линий она
фактически лишена С-сегмента. Это дает возможность легко и надежно
определять пол клетки. С-метод, применяемый в нашей лаборатории (см.
также гл. 4, разд. 2.4), описан в табл. 5 5 и иллюстрирован рис. 5.3, Д.
136
Глава 5
Рис. 5.3. А. Мужская метафаза. Препарат окрашен по Гимза, хорошо заметны
вторичные перетяжки (помечены маленькими стрелками) и Y-хромосома
(большие стрелки). Y-хромосома идентифицируется благодаря сближенным
параллельным хроматидам и маленькому короткому плечу. Б. Маркерная
хромосома Тб (указана стрелкой) в гомозиготном состоянии. Это результат
неравной реципрокной транслокации Т(14; 15)6Са [17], но рутинное окраши-
Кариотипирование гамет, эмбрионов и плодов
137
Таблица 5.5. С-окраска хромосом
В литературе описаны многочисленные С-методы (см. также гл. 4, разд.
2.4); большинство из них дает хорошие результаты, однако некоторые могут
нарушать морфологию хромосом. Описанный ниже метод эффективен, прост н не
влияет на морфологию. Препараты, приготовленные этим способом, могут быть
использованы в течение 1-30 дней.
1. Поместите препараты в 5 М НС1 при комнатной температуре на 5 мин.
2. Отмойте препараты от кислоты в проточной воде и поместите в 2XSSC (0,3
М хлорид натрия/0,03 М трехзамещенный цитрат натрии) в закрытый сосуд
Коплина на 15 мин при +65 °С.
3. Поместите в буферный раствор pH 6,8 (таблетки Gurr) при комнатной
температуре на 5 мин.
4. Окрасьте по Гимза (2-3% Merck Giemsa) в буферном растворе pH 6,8.
Просматривайте мокрые стекла при Х128.
5. Если контраст между С-сегментом и остальной хромосомой достаточен,
сполосните стекла буфером, промокните и высушите окончательно струей
воздуха из резиновой груши.
6. Сухие стекла для постоянных препаратов заключите в DePex или Eukitt и
накройте покровными стеклами; временные препараты смотрите с масляной
иммерсией, наноси масло прямо на поверхность стекла.
