Биология развития млекопитающих - Манк М.
ISBN 5-03-001333-4
Скачать (прямая ссылка):
улучшить добавлением трех капель фиксатора в тот момент, когда капли
клеточной суспензии начинают высыхать на стекле; пусть фиксатор полностью
растечется, а затем высушивайте, как описано выше.
9. Стекла можно окрасить рутинным способом (разд. 5.1), применить С-ме-
тод (разд. 5.2), G-метод (разд. 5.3) или использовать для гибридизации in
situ.
размягчения" по методу Дыбана и Баранова [7] или так, как описано в табл.
5.3,Л.
4.3. Препараты зародышей постимплантационных стадий
Выбор технического приема определяется составом и размером объекта, а
также целью исследования. Можно первоначально иметь дело с компактным
материалом и диссоциировать зародыш после фиксации, можно диссоциировать
его сразу и дальше иметь дело с клеточной суспензией. Учитывая размеры
большинства эмбрионов (^5 мм), описанных в гл. 3, более предпочтительной
представляется работа с компактными объектами. Плодные оболочки эмбрионов
также лучше иметь в виде компактного материала, так как они плохо
поддаются механической диссоциации. После гипотонического воздействия и
фиксации плотные ткани диссоциируют в уксусной кислоте (способ описан в
табл. 5.3, А). Такие препараты обычно очень информативны после С-окраски,
но редко выявляют хорошую сегментную дифференцировку хромосом после
применения С-ме-тода. Если нужны препараты целых эмбрионов старшего
возраста (J*5 мм) или более крупных органов, таких, как печень или
селезенка 12-20-дневных эмбрионов, материал сначала переводят в
суспензию, а затем проводят, как описано в табл. 5.3, Б.
Кариотипирование гамет, эмбрионов и плодов
133
V
.. ... Г. / л?.;
Ф v5> *
Рис. 5.2. Л. Морула с пятью митотическими клетками. Вследствие того, что
отец был гетерозиготным по семи различным Робертсоновским транслокациям,
клетки содержат метацеитрические хромосомы. Б. Раииий триплоид с девятью
митотическими клетками, также содержащими метацеитрические хромосомы.
Хотя эта методика предполагает большие затраты времени, препараты
митотических клеток, полученные с ее помощью, лучше по качеству и
пригодны для выявления сегментной дифференцировки хромосом (рис. 5.5) и
гибридизации in situ (разд. 6).
Как следует из гл. 3 (разд. 2), процессы роста и развития раннего плода
обеспечивают богатый источник митотических делений. По мере их замедления
и с переходом к дифференци-ровке (после 14 дня) митотический индекс
быстро падает как в эмбрионе, так и в оболочках плода, затрудняя
получение хромосомных препаратов с поздних стадий, особенно незадолго до
рождения. После рождения митотическая активность возобновляется, и в
течение 5 дней можно получать превосходные препараты из печени и
селезенки. У раннего эмбриона высокий митотический индекс позволяет
обойтись без блокатора митоза (колцемид, Sigma или винбластин, Lilly), но
если митотический индекс низок, как у поздних эмбрионов, применяют
блокаторы. Введение таких соединений матери не рекомендуется, так как
плацентарный барьер препятствует их проникновению в плод. Блокатор можно
инъецировать непосредственно в поздиий
134
Глава 5
эмбрион, но эта процедура требует хирургического искусства от
экспериментатора и может травмировать мать. Более простой способ введения
блокатора заключается в извлечении ткани и ее кратковременном
инкубировании в культуральной среде (см. гл. 3, разд. 5 и 6), содержащей
0,1% мкг/мл колцемида или винбластина.
Эмбрионы мыши с несбалансированными хромосомными наборами, как правило,
погибают между 6 и 15 днем [8]. Хотя митотическая активность у них падает
за несколько часов или даже дней до гибели, препараты митоза все-таки
можно получить из оболочек плода. Их анализ позволяет установить, связана
ли смерть с аномалиями хромосом. Пригодность внезаро-дышевых оболочек для
кариотипироваиия дает возможность проводить исследования, в которых
необходимо сохранить эмбрион интактным независимо от того, нормален он
или нет.
5. Окрашивание хромосомных препаратов
5.1. Хромосомы мыши после рутинной окраски
Нормальная мышь имеет 40 хромосом, все хромосомы акро-центрические или с
почти невидимыми короткими плечами. Размер хромосом в метафазе варьирует
от 2 до 5 мкм. Уровень разрешения, который обеспечивается рутинным
окрашиванием, не достаточен для анализа хромосом. Лишь некоторые аутосомы
имеют отличительные признаки (вторичные перетяжки) (рис. 5.3,Л), а из
половых хромосом удается идентифицировать только Y-хромосому (рис. 5.3,
Л). Рутинное окрашивание позволяет лишь подсчитать число хромосом в
ситуациях, когда подозревается анеуплоидия. Некоторые методики рутинного
окрашивания представлены в табл. 5.4.
Однородная морфология мышиных хромосом, окрашенных рутинным способом,
препятствует выявлению химерности или мозаицизма. Эта проблема может быть
решена использованием для мечения клеток маркерных хромосом. Маркерами
могут служить более длинные или более короткие хромосомы, полученные
путем индуцированной неравной реципрокной транслокации или
