Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Манк М. -> "Биология развития млекопитающих " -> 52

Биология развития млекопитающих - Манк М.

Манк М. Биология развития млекопитающих — М.: Мир, 1990. — 406 c.
ISBN 5-03-001333-4
Скачать (прямая ссылка): biologiyarazvitiyamlekopitaushih1990.djvu
Предыдущая << 1 .. 46 47 48 49 50 51 < 52 > 53 54 55 56 57 58 .. 162 >> Следующая

пипеткой с широким отверстием перенесите ткань из гипотонического
раствора в 10-кратио превышающий объем фиксатора. Можно удалить
гипотонический раствор пипеткой и добавить к объекту нужный объем
фиксатора. Смешивание растворов вызывает движение жидкости, кроме того,
маленькие кусочки в фиксаторе часто становятся прозрачными и за ними надо
следить, чтобы ие потерять. Фиксированный материал можно хранить в
достаточно большом объеме фиксатора до 3 мес при 4 СС.
Продолжение табл. 5.3
4. Дезагрегируйте в 5-кратном объеме водного раствора 60%-ной ледяной
уксусной кислоты при комнатной температуре. Контролируйте процесс в
препаровальном микроскопе.
5. Примерно через 5 мни сделайте пробный препарат, нанеся иа предметное
стекло 0,5 мл суспензии, поместите стекло на нагревательный столик при
40-60 °С. Поддерживайте суспензию в движении, т. е. покачивайте стекло,
чтобы капля по нему растекалась, или пипетируйте, перемещая каплю иа
свежую поверхность стекла. По мере того как капля перемещается по стеклу
и уменьшается, клетки будут распластываться на поверхности стекла. Более
высокая температура (60°С) быстрее высушивает препарат, однако низкая (40
°С) часто дает препараты лучшего качества.
6. Просмотрите препарат под фазово-контрастным микроскопом Х128 и, если
качество его удовлетворительно, делайте следующие.
7. Если пробный препарат неудовлетворителен, из клеточной суспензии
сделайте еще один; если дезагрегация идет медленно, помогите часовым
пинцетом или пипетироваиием. Увеличение времени обработки 60%-иой
уксусной кислотой приводит к мацерации н повреждению митотических клеток.
8. Маленькие (=s:l мм) кусочки ткани можно дезагрегировать в капле 60%-
ной уксусной кислоты прямо на стекле. В этом случае следует обратить
внимание на то, чтобы с самого начала мацерации кусочек находился в
центре капли, иначе он может подсохнуть до отделения, клеток.
9. Клетки можно окрасить рутинным способом (разд.. 5.1) нли использовать
С-метод (разд. 5.2).
Б. Метод клеточной суспензии
1. Приготовьте образцы целых плодов (размером 5-10 мм) или целых органов,
таких, как печень или селезенка 12-20-дневных эмбрионов, и суспендируйте
их, разрывая пинцетом и пипетируя в достаточном объеме среды (X 10),
например ТС199 или МЕМ.
2. Наклоните чашку, чтобы дать осесть крупным фрагментам ткани до
отделения иадоеадочной жидкости со взвесью клеток. Если используется бло-
катор митоза (колцемид или винбластин 0,1 мкг/мл), инкубируйте клеточную
суспензию около 1 ч при 36-37 °С.
3. Отцентрифугируйте клеточную суспензию в 10-мл конической стеклянной
центрифужной пробирке при 200 g в течение 5 мин, отбросьте надосадоч-ную
жидкость, ресуспендируйте клеточные сгустки в 10-кратном объеме
гипотонического раствора 1%-иого трехзамещенного цитрата иатрня или
0,56%-ного хлорида калия при комнатной температуре. Препараты
эмбриональной печени и селезенки после обработки хлоридом калия
становятся более чистыми, поскольку это соединение вызывает лизис
эритроцитов. Для клеток молодых плодов время воздействия 0,56%-ным
хлоридом калия должно составлять 6-8 мни, в 1%-ном трехзамещенном цитрате
натрня - 8-10 мин, для клеток плодов более поздних стадий время обработки
увеличивается. Оптимальные сроки устанавливаются экспериментальным путем.
4. Центрифугируйте клеточную суспензию при 200 g в течение 5 мин, удалите
надосадочиую жидкость и фиксируйте клеточные сгусткн, осторожно добавляя
пипеткой 5 мл свежеприготовленной смеси метанол: ледяная уксусная кислота
(3 : 1). Фиксация является критической стадией при изготовлении
препарата, она получается лучше, если вначале внести фиксатор, не нарушая
целостности клеточного сгустка, затем удалить его, прибавить следующую
порцию, после чего энергично диспергировать сгусток, постукивая по
пробирке пальцем и одновременно добавляя еще .одну порцию фиксатора для
ресуспенднровання клеток. О проникновении, фиксатора в сгусток можно
судить по изменению его окраски с кремовой на белую: вся процедура
фиксации должна занимать от 2 до 5 мин. Более длнтель-
9*
132
Глава 5
Продолжение табл. 5.3
ное воздействие фиксатором может уплотнить сгусток и затруднить
диспергирование.
5. Центрифугируйте при 200 g 5 мни и ресуспендируйте в небольшом объеме
фвксатора.
6. Поместите 3 капли суспензии в ряд на чистое стекло. Дайте каплям
полностью растечься, и когда они начнут высыхать (появятся
интерференционные кольца), подышите на стекло и подержите его вблизи
настольной лампы (50 Вт). Сочетание потока влажного воздуха с мягким
теплом способствует хорошему распластыванию метафаз.
7. Просмотрите стекло под фазово-контрастным микроскопом при Х128 и, если
потребуется, нанесите следующие капли суспензии и повторите процедуру
высушивания.
8. Если митотические клетки ие распластались нужным образом (из-за
недостаточного воздействия гипотонии на предыдущем этапе или потому, что
хромосомы остались в цитоплазме) качество препаратов можно значительно
Предыдущая << 1 .. 46 47 48 49 50 51 < 52 > 53 54 55 56 57 58 .. 162 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed