Биология развития млекопитающих - Манк М.
ISBN 5-03-001333-4
Скачать (прямая ссылка):
129
числом митозов, доступных для анализа. Чтобы увеличить их количество,
разработаны специальные методические приемы. К ним относятся
суперовуляция и инъекция
самке блокатора митоза за несколько часов до извлечения эмбриона. Важно
помнить, что последняя процедура хотя и увеличивает долю клеток с
митотическими фигурами, но может привести и к интенсивному сокращению
хромосом, затрудняющему анализ. Следует не затягивать время действия
блокатора больше чем на 4 часа. Этого достаточно чтобы 50-80% эмбрионов
накопили Рис. 5.1. Пронуклеарные хромосомы метафазные пластинки. Точ- с
удлиненным мужским комплемен-
пые представления о скорости гом вверху, вблизи полярного тель-
н ца. Клетка окрашена С-методом для
дробления И отклонениях, идентификации Y-хромосомы (отме-свойственных
конкретной ЛИ- чена стрелкой). Поскольку на прении мышей, помогают
экспери- парате хромосомные наборы разоб-ментатору подобрать нужное
1чеиь|- они сфотографированы от-время воздействия блокато- дель
ром митоза.
Предимплантационное развитие может иметь место и в условиях культуры (гл.
2), в этом случае блокатор митоза добавляют в среду культивирования. При
этом препараты готовят точно так же, как и в случае извлечения эмбрионов
из организма матери.
Следует заметить, что яйца с аномальным кариотипом часто запаздывают в
развитии по сравнению с нормальными [6] и вследствие этого могут остаться
невыявленными. Если в задачу входит именно выявление анеуплоидии,
требуется анализ такого количества митотических клеток, которое обеспечит
достоверный результат.
Наиболее распространенный метод получения препаратов хромосом
предимплантационных эмбрионов разработан Тарковским [5] (табл. 5.2).
Если действие гипотонического раствора и фиксация строго контролируются,
можно получить вполне удовлетворительные препараты зародышей большинства
предимплантационных стадий (рис. 5.2), за исключением стадии очень
поздней бластоци-сты. Это можно сделать и при помощи "двойной фиксации и
9- 171
Таблица 5.2. Препараты зародышей предимплантационных стадий
1. Беременных самок, время спаривания которых обеспечивает нужную стадию
развития, инъецируйте внутрибрюшинно 0,25 мл 0,04%-ного водного раствора
колцемида или винбластнна. Оставьте на 4 ч и извлеките эмбрионы, как
описано в гл. 2, разд. 5.2. Можно культивировать эмбрионы с добавлением
блокатора митозов в среду (0,1 мкг/мл).
2. Перенесите яйца в гипотонический водный раствор 1%-ного трехзамещен-
ного цитрата натрия или 0,56%-ного хлорида калия. Поскольку последний
является более эффективным гипотоническим агентом и может быстро нарушить
метафазу на такой чувствительной стадии, как раннее дробление,
рекомендуется, пока не появится опыт, работать с цитратом натрия.
3. Время воздействия гипотоническим раствором варьируйте в зависимости от
стадии развития: двуклеточиая стадия исключительно чувствительна, н
обработка в течение 2 мин может быть достаточной. Поздние бластоцисты
более устойчивы и могут потребовать до 15 мин. Чтобы сэкономить время,
поместите в серию стекол с луикой по одному эмбриону н инкубируйте в
гипотоническом растворе разное время (с интервалом в 1 мин). Если в опыте
находится партия асинхронно развивающихся эмбрионов, начните с более
ранних, так чтобы эмбрионы более поздних стадий оказались иод большим
воздействием гипотонии.
4. Приготовьте препараты, как было описано для проиуклеариой стадии
(табл. 5.1), используя всякий раз по одному эмбриону, чтобы избежать
перекрывания хромосомных наборов при распластывании. Обычно одной капли
фиксатора достаточно для фиксации и распластывания ранних мо-рул и
бластоцист, поздиие бластоцисты требуют нескольких капель.
5. Для окраски можно применить рутинный способ (разд. 5.1), С-метод
(разд. 5.2) или G-метод (разд. 5.3).
Таблица 5.3. Препараты хромосом из зародышей постимплаитациониых стадий
А. Метод диссоциации уксусной кислотой
1. Приготовьте образец ткани, которым может быть весь плод или его часть
(гл. 3, разд. 3 и 4) и, если требуется, инкубируйте при 36-37 °С в
течение 1 ч в среде (гл. 3, разд. 5 и 6), содержащей блокатор митозов,
такой, как колцемид или винбластии, в концентрации 0,1 мкг/мл.
Предпочтительнее пользоваться стеклянными, а ие пластмассовыми
контейнерами, так как пластик в ходе этой процедуры может частично
растворяться. Если объект крупный (5 мм), для увеличения поверхности и
лучшего проникновения растворов разрежьте его на небольшие кусочки.
2. Поместите ткани в водный раствор 1%-иого трехзамещениого цитрата
натрия или 0,56%-иого хлорида калия. Оптимальное время обработки должно
быть установлено экспериментальным путем. Например, эмбрион 6-го дия
развития очень чувствителен и требует всего лишь 3-4 мни воздействия
0,56%-иым хлоридом калия или 4-6 мии 1%-иым трехзамещен-иым цитратом
натрия.
3. Фиксируйте ткань свежеприготовленной смесью метанол : уксусная кислота
3 : 1 (фиксатор пригоден не более 3 ч после приготовления). Пинцетом или
