Биология развития млекопитающих - Манк М.
ISBN 5-03-001333-4
Скачать (прямая ссылка):
смеси абсолютного спирта с концентрированной НС1 (1:1), на следующий день
тщательно промыть водопроводной водой, сполоснуть деионизированной водой
и хранить в смеси абсолютный спирт:диэтиловый эфир (1:1). Непосредственно
перед употреблением взять стекла пинцетом, не прикасаясь к ним пальцами,
и промокнуть досуха грубоволокнистым обезжиренным материалом, таким, как
Kimwipes.
4. Препараты хромосом из эмбрионов и плодов
4.1. Препараты из зигот
Анализ митотических препаратов, полученных с пронуклеар-ных стадий,
позволяет выявить хромосомные наборы гамет. Оплодотворенное яйцо
позволяет судить о хромосомном вкладе самца и самки, в неоплодотворенных
яйцах можно выявить хромосомы самки после активации партеногенеза целым
рядом воздействий ([1], гл. 12). Изучение пронуклеарного деления
оплодотворенных яиц дает информацию о хромосомных аномалиях, часть
которых может быть причиной зиготических деталей или проявиться в
последующих делениях дробления. Гаплоидные яйца с единственным
пронуклеусом, полученные в результате активации, незаменимы при анализе
партеногенеза у млекопитающих [2].
Эмбриологический материал, полученный после естественной овуляции и
спаривания, обладает рядом недостатков, объясняющихся асинхронностью
оплодотворения. Чтобы избежать их, обычно прибегают к процедурам, которые
могли бы усовершенствовать естественный процесс. Одна из таких процедур -
суперовуляция (гл. 1, разд. 5.4). Она увеличивает число получаемых яиц и
синхронность развития, а в комбинации с веществами-цитостатиками в
большой степени способствует успеху экспериментов.
Для получения хромосомных препаратов предложены многочисленные методики
in vivo и in vitro [3, 1, 4]. Они имеют между собой много общего.
Большинство из них предполагает фиксацию и распластывание хромосом по
методу Тарковско-
128
Глава 5
Таблица 5.1. Приготовление хромосомных препаратов из зигот
1. Индуцируйте суперовуляцию внутрибрюшинной инъекцией 5 ME СЖК н через
40-48 ч 5 ME чХГ (см. гл. 1, разд. 5.4). После чХГ обеспечьте спаривание.
2. Забейте самок вскоре после полудня следующего дня и извлеките яйца из
ампул яичников (гл. 2, разд. 2.1), поместите в культуральную среду (М2,
гл. 2, разд. 5.2).
3. Пронуклеарный митоз должен пройти следующей ночью между 28 н 32 ч
после инъекции чХГ. Обычно блокатор митоза добавляют в среду за несколько
часов до деления ядра, однако в данном случае, если экспериментатор не
ставит специальной цели получить неконденсированные хромосомы,
целесообразно внести блокатор (0,1% мкг/мл колцемида или винбла-стина) в
начале культивирования и оставить в нем яйца на всю ночь.
4. На следующий день удалите клетки кумулюса гиалуронидазой (гл. 2,
Йазд. 2.1) н промойте клетки чистой средой.
ока не появится опыт, проводите яйца партиями по три. Первую тройку
поместите в глубокое стекло с лункой, содержащее 1 мл гипотонического
водного раствора 1%-ного трехзамещенного цитрата натрия или 0,56%-ного
хлористого калия. В первом случае оставьте яйца в растворе на 7-10 мин,
во втором достаточно 6-8 мин.
6. Втяните яйца микропипеткой, отверстие которой чуть больше диаметра
яйца (следует заметить, что в гипотоническом растворе яйца разбухают,
поэтому оии могут закупорить пипетку, которая к ним подходила по диаметру
до воздействия), и поместите их в минимальном объеме гипотонического
раствора на середину чистого предметного стекла. Тарковский [5], автор
методики, указывает, что капля остаточного гипотонического раствора не
должна превышать 2 мм в диаметре. Излишки его могут вызвать разрыв и
потерю хромосом, а недостаточное количество препятствует их
распластыванию.
7. Осторожно нанесите на яйца одну каплю (~ 0,02 мл) свежеприготовленного
фиксатора (смеси метанол : ледяная уксусная кислота 3:1) так, чтобы эта
капля поглотила остаточный раствор. Между помещением янц на стекло и их
фиксацией не должно пройти более 1-2 сек, иначе яйца начнут уплощаться
преждевременно и не получится распластывания. Капайте фиксатор с высоты
не менее 2 см, в противном случае на яйца подействуют пары фиксатора и
они также не распластаются.
8. Дайте капле фиксатора растечься. Это способствует высыханию. Подуйте
на стекло н подержите его над нагревательным столиком.
9. Продолжайте с другими партиями яиц. Количество яиц в партии может быть
увеличено, но при этом следите, чтобы яйца не располагались настолько
близко друг к другу, чтобы их содержимое могло смешаться.
10. Полученные стекла могут быть окрашены рутинным способом (разд. 5.1),
С-методом (разд. 5.2) или G-методом (разд. 5.3).
го [5]. Один из методов получения хромосомных препаратов представлен в
табл. 5.1 и проиллюстрирован на рис. 5.1.
4.2. Приготовление препаратов из зародышей предимплантационных стадий
Препараты хромосом могут быть получены из зародышей всех
предимплантационных стадий (описание см. в гл. 2). Успех операции
определяется числом миотически делящихся яиц и
Кариотипирование гамет, эмбрионов и плодов
