Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Манк М. -> "Биология развития млекопитающих " -> 148

Биология развития млекопитающих - Манк М.

Манк М. Биология развития млекопитающих — М.: Мир, 1990. — 406 c.
ISBN 5-03-001333-4
Скачать (прямая ссылка): biologiyarazvitiyamlekopitaushih1990.djvu
Предыдущая << 1 .. 142 143 144 145 146 147 < 148 > 149 150 151 152 153 154 .. 162 >> Следующая

высоким количеством круглых клеток (табл. 14.5) обязательно надо
подвергать бактериологическому контролю.
6.3. Подготовка сперматозоидов для оплодотворения in vitro
Целью соответствующих процедур является получение образца семени,
обогащенного подвижными спермиями и свободного от клеток и дебриса.
Техника "флотации" (табл. 14.6) представляет собой простой метод
получения фракции, обогащенной подвижными спермиями. Разделение
сперматозоидов центрифугированием в самоформирующихся градиентах плавучей
плотности [31] (табл. 14.7 и 14.8) даст возможность не только
относительно быстро получать популяции спермиев с высокой подвижностью;
при этом отбираются спермин с нормальной
25-171
Таблица 14.6. Метод "флотации* сперматозоидов
1. Оставьте сперму для разжижения при комнатной температуре иа 30 мин"
Внесите примерно 2 мл в стерильную пластиковую пробирку (Falcon 2001).
2. Определите концентрацию и подвижность.
3. Добавьте 10 мл EBS+БСА или EBS+10%-ную сыворотку, инактивированную
нагреванием. Тщательно перемешайте осторожным пипетированием. стерильной
пастеровской пипеткой.
4. Центрифугируйте при 200 g в течение 5-10 мин. Удалите пастеровской,
пипеткой супернатант, оставив 0,5 мл. Ресуспендируйте сгусток осторожным
перемешиванием оставшегося супернатанта.
5. Прибавьте 1-2 мл свежей среды, очень осторожно спуская ее по
внутренней стенке пробирки так, чтобы оиа наслоилась на поверхность
суспензии спермиев, не перемешав ее. Если концентрация спермиев в образце
низка, пограничную область между семенем и средой можно увеличить,
поместив небольшие объемы семени (0,5 мл) в ряд пробирок. (Falcon 2002) и
наслоив на них по 0,5-1 мл среды. Для получения нужной концентрации
спермиев супернатанты из всех пробирок соединяются.
6. Оставьте пробирки в инкубаторе с 5% С02 при 37° на 20-30 мин. В
течение этого времени подвижные спермин должны мигрировать в наслоенную
среду, оставив на дне пробирки мертвые спермин, дебрис н иные клетки.
Если пробирки будут установлены под небольшим углом, увеличится площадь
контакта суспензии со средой и соответственно выход подвижных спермиев.
7. Осторожно отсосите 0,5-1 мл чистого супернатанта. Для определения
концентрации и подвижности спермиев возьмите соответственно 50 н 10 мкл.
8. Доведите концентрацию суспензии путем разведения, центрифугирования н
ресуспендирования до нужной величины в пределах от 2 до 5 мли. подвижных
спермиев/мл.
Таблица 14.7. Градиенты перколла в EBS для центрифугирования в градиенте
плавучей плотиости
Для поддержания стерильности растворов работайте в ламинарном боксе
1. Растворите 1,25 г фракции V БСА в 25 мл EBS десятикратной концентрации
(Х10 EBS+исходный раствор БСА). Стерилизуйте фильтрованием (Millipore
0,22 мкм).
2. Поместите 90 мл перколла (Percoll, Pharmacia) в стерильный контейнер и
маркируйте этикеткой "90%-иый перколл в EBS + БСА".
3. Поместите 90 мл культуральной ультрачистой воды в отдельный стерильный
контейнер и пометьте: "EBS+БСА".
4. В каждый контейнер добавьте:
10 мл (хЮ) EBS+исходный раствор БСА (см. п. 1),
100 мкл концентрированного (ХЮ) исходного раствора пирувата натрия (11
мг/мл),
0.2 мл исходного гентамицина (табл. 14.1),
10 мкг исходного пенициллина (табл. 14.1).
5. В контейнер "EBS+БСА" добавьте 1,3 мл 7,5%-ного бикарбоната натрия
(Flow Labs или приготовьте).
Для приготовления 60%-ных градиентов перколла
6. Работая в стерильных условиях, поместите в автоклавированные поли-
карбонатные центрифужные пробирки (Sorvall, Du Pont, 03115):
6 мл 90%-ного перколла в- EBS+БСА,
3 мл EBS+БСА.
Оплодотворение ооцитов человека
379
Продолжение табл. 14.7
7. Тщательно перемешайте, переворачивая закрытые пробирки.
8. Центрифугируйте 15 мин при 20 °С (29 ООО g) в центрифуге с угловым
ротором (Sorvall, head SS34 при 15 000 об/мин).
9. Храните центрифугированные колонки перколла в морозильнике.
10. Плотность разных слоев градиента можно тестировать в образце
градиента путем добавления смеси гранул - маркеров плотности (Pharmacia.
Кат. № 17-0459-01).
Таблица 14.8. Разделение спермиев в градиентах перколла [21]
1. Оставьте колонку перколла для нагревания до комнатной температуры.
2. Загрузите в колонку 1-3 мл семенн.
3. Центрифугируйте в течение 20 мин в бекет-роторе при 400 g.
4. Отсосите снизу 1 мл, опустив ко дну центрифужной пробирки иглу для
спинномозговой пункции 19G (Becton Dickinson), присоединенную к шприцу на
1 мл. Если в вашем распоряжении есть полимерные пробирки, эту операцию
можно сделать путем прокалывания основания пробирки после его дезинфекции
спиртом.
5. Самый нижний слой должен содержать высокоподвижные, морфологически
нормальные спермин в количестве, достаточном для оплодотворения in vitro.
Тем же способом можно получить аликвоты выше расположенных слоев, но
подвижность и морфология спермиев соответственно будет более низкого
качества. Неподвижные сперматогенные клетки, лейкоциты и деб-рис обычно
локализуются в верхних слоях, под границей раздела спер-ма/перколл.
Предыдущая << 1 .. 142 143 144 145 146 147 < 148 > 149 150 151 152 153 154 .. 162 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed