Биология развития млекопитающих - Манк М.
ISBN 5-03-001333-4
Скачать (прямая ссылка):
Analar (BDH) является химически чистой и в принципе подходит для
оплодотворения и культивирования, но она не стерильна, хранится в больших
объемах, поэтому может содержать бактериальные токсины. С другой стороны,
вода для инъекций (BDH) стерильна и не обладает пирогенностью, упакована
в подходящих объемах и готовится в строго контролируемых стандартных
условиях. По-видимому, именно вода для инъекций и промываний (Boots)
удовлетворяет требованиям культивирования человеческих эмбрионов.
4.4. Масло
В течение ряда лет мы используем легкое парафиновое масло (BDH). Метод
приготовления основного запаса масла описан Праттом (гл. 2, разд. 5.1).
Небольшие его количества, необходимые для немедленного употребления,
сначала отмывают средой для тканевой культуры путем энергичного
перемешивания примерно 200 мл EBS с 500 мл масла в литровом стерильном
флаконе для культуры ткани (Nunc). Затем эмульсии дают разделиться на две
фазы. Масло хранят до употребления при комнатной температуре в этом же
контейнере (т. е. плаваю-
368
Глава 14
щим на поверхности среды). Как и в случае всех ингредиентов, используемых
для культуры ткани, необходим жесткий контроль качества масла. Для
проверки реактивов на токсичность применяется культивирование мышиных
эмбрионов в блестящей оболочке и без нее до стадии бластоцисты (см. гл.
2, разд. 6).
Потенциальный риск токсичности масла [20] и время, требующееся для
проверки его качества [13], заставили исследователей обратиться к поискам
альтернативных путей работы с небольшими объемами среды. Ведь масло
используется для предотвращения изменения осмолярности, которое имеет
место в результате испарения воды в ходе инкубации, но оплодотворение и
культивирование можно осуществлять и в тест-пробирках (Falcon 2001,
Becton Dickinson) в объемах около 1 мл в увлажненной атмосфере.
4.5. Антибиотики
Антибиотики добавляют к большинству сред для ингибирования роста
микроорганизмов. Последние могут быть занесены из окружения, иногда они
представлены патогенными формами, присутствующими в самом образце [21].
Поскольку пенициллин и стрептомицин наиболее часто используются в
качестве антибактериальных средств, имеет смысл специально остановиться
на двух вопросах, касающихся применения этих антибиотиков при
оплодотворении ооцитов человека.
Аллергия на пенициллин встречается весьма часто, поэтому мы советуем либо
вообще исключить этот антибиотик из всех сред для промывания фолликулов и
процедур переноса эмбрионов, либо иметь специальный запас сред без
пенициллина для склонных к аллергии пациентов. Применение бактериального
фильтра (Millex-GV, Millipore), предусмотренное в протоколе процедуры
вымывания ооцитов, защитит пациента при операции в случае занесения
бактерий в среду.
Грамотрицательные бактерии наиболее часто встречаются в бактериальных
контаминациях, возможных при оплодотворении in vitro [22]. Именно эти
бактерии, как правило, инфицируют женский половой тракт при перенесении
эмбрионов. Известно, что Escherichia coli прочно связывается со
сперматозоидами и может оказаться не удаленной в процессе приготовления
препарата для оплодотворения [21]. Хотя стрептомицин пока эффективен в
отношении многих грамотрицательных патогенов, устойчивость
микроорганизмов к этому антибиотику повышается. Более эффективным нам
представляется применение гента-мицина (Sigma-Shering) в концентрации 20
мкг/мл.
Оплодотворение ооцитов человека
369
4.6. Газы
Большинство сред, применяемых для оплодотворения и культивирования
эмбрионов in vitro, содержит 25 мМ. бикарбоната Na, который обеспечивает
pH 7,2-7,4 в результате газации 5% СОг. Пока еще нет определенности в
отношении идеальной концентрации кислорода, потребляемого человеческим
эмбрионом при развитии in vitro. В ранних работах, выполненных на мышиных
и коровьих эмбрионах, было показано, что развитие до стадии бластоцисты
in vitro лучше происходит в 5%-ном Ог [23]. Между тем высокая частота
формирования бластоцист мышиными эмбрионами обычно наблюдается при
культивировании в среде с 5% С02 в воздухе (21% 02). Пока не получено
надежных сравнительных показателей для развивающегося эмбриона человека,
частота формирования бластоцист у которого низка в обеих газовых смесях.
Однако частота успешной имплантации примерно одинакова для эмбрионов,
растущих в 5% С02 в воздухе и в смеси 5% С02:5% 02:90% N2.
4.7. Температура
Температура инкубаторов для оплодотворения ооцитов человека и
культивирования предимплантационных эмбрионов должна поддерживаться в
пределах 37-37,5°С. Температуры ниже нормальных могут прерывать
полимеризацию микротрубочек и влиять таким образом на формирование
мейотического веретена, поэтому среда для вымывания ооцитов из фолликулов
должна быть теплой и ооциты после обнаружения их в аспирате необходимо
переносить в теплую среду как можно быстрее.
5. Ооциты
5.1. Манипуляции с ооцитами
Как только ооцит найден в аспирате, отсосанном из фолликула, его следует
