Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Манк М. -> "Биология развития млекопитающих " -> 143

Биология развития млекопитающих - Манк М.

Манк М. Биология развития млекопитающих — М.: Мир, 1990. — 406 c.
ISBN 5-03-001333-4
Скачать (прямая ссылка): biologiyarazvitiyamlekopitaushih1990.djvu
Предыдущая << 1 .. 137 138 139 140 141 142 < 143 > 144 145 146 147 148 149 .. 162 >> Следующая

4. Медленно добавьте пипеткой раствор бикарбоната натрия, осторожно
встряхивая. Делайте это очень медленно, тогда в растворе не образуется
осадок карбоната кальция. Если все же раствор замутится, вылейте и
повторите сначала.
5. Введите 33,6 мл исходного раствора HEPES (табл. 14.1).
6. Проверьте осмоляриость (она должна быть в пределах 280- 285
мОсмоль/л). Если значение слишком низкое, добавьте концентрированного
EBS.
Среда для получения ооцитов
7. Добавьте 350 мкл гепарина (табл. 14.1) к 350 мл ЕВ$, забуференного
HEPES. Стерилизуйте миллипоровой фильтрацией. Храните в холодильнике
аликвотами по 50 мл в культуральных флаконах.
8. Профильтруйте остальные 50 мл основного HEBS для приготовления среды,
в которую будете помещать эмбрионы (среды для переноса).
Продолжёние табл. 14.2
Приготовление среды для переноса эмбрионов (содержащей сыворотку
материнской крови (10%), инактивированную нагреванием):
9. Добавьте 2 мл инактивированной нагреванием сыворотки (табл. 14.4) к
18 мл HEBS.
10. Желательная процедура. Стерилизуйте фильтрацией (миллипоровый
фильтр), отбросив первые 0,5-1 мл профильтрованного раствора (в фильтрах
могут содержаться увлажняющие агенты, способные ингибировать нормальное
эмбриональное развитие).
11. Храните в морозильнике в стерильных пробирках или флаконах.
Таблица 14.3. Среда для оплодотворения in vitro и культивирования
эмбрионов (EBS, забуферениый бикарбонатом)
Для получения 100 мл исходного раствора EBS, забуференного бикарбонатом:
1. Разморозьте одну аликвоту (на 1 мл) пирувата натрия (табл. 14.1).
2. Взвесьте 0,21 г бикарбоната натрия. Добавьте 10 мл воды и растворите.
3. Отмерьте 10 мл десятикратного раствора EBS в коническую колбу.
Добавьте 77 мл воды и оттаявшую аликвоту пирувата натрия.
4. Медленно внесите с помощью пипетки раствор бикарбоната натрия,
осторожно встряхивая. Медленное добавление не вызовет образования
карбоната кальция, который может замутить раствор. Если раствор все же
получился мутным - выбросьте его и начните сначала.
5. Добавьте 10 мкл раствора пенициллина (табл. 14.1) и 0,2 мл раствора
гентамицина (табл. 14.1).
6. Проверьте осмолярность (она должна быть в пределах 280- 285
мОсмоль/л). Если значение слишком высокое, добавьте воды, если низкое -
концентрированный раствор EBS.
Приготовление среды для оплодотворения in vitro-.
7. Добавьте 0,4 г БСА (табл. 14.1) к 80 мл EBS и оставьте для
постепенного естественного растворения. Не встряхивайте, иначе раствор
будет пениться и образуются труднорастворимые хлопья. Профильтруйте через
миллипоровый фильтр и храните аликвотами по 10 мл в пластиковых пробирках
(Falcon) (№ 2001) в морозильнике.
8. Профильтруйте остальные 20 мл исходного раствора н храните аликвоты по
4 мл в фолконовских пробирках (№ 2002) в морозильнике (приготовление
культуральной среды для эмбрионов см. ниже).
Среда для культивирования эмбрионов (содержащая сыворотку материнской
крови, инактивированную и нагреванием)'>
9. Извлеките 0,4 мл EBS из одной 4-мл аликвоты, хранящейся в
морозильнике, и замените этот объем EBS 0,4 мл инактивированной
нагреванием сыворотки.
10. Желательаня процедура. Профильтруйте через миллипоровый фильтр,
первые 0.5-1 мл отбросьте.
11. Используйте каплями по 500-100 мкл под маслом для культивирования
эмбрионов, начиная со стадии пронуклеусов.
') Чтобы получить 15%-ную сыворотку, удалите 0.6 мл из 4-мл аликвоты EBS
п 9 и замените их 0,6 мл сыворотки.
Оплодотворение ооцитов человека
367
Таблица 14.4. Приготовление сыворотки материнской крови
и среды для переноса
1. В асептических условиях возьмите 10-15 мл крови, воспользовавшись ие-
токсическнм шприцем для культуры ткани (Steriseral, No. 1. Medical).
2. Извлеките иглу и опорожните шприц в 15-мл стерильную пластиковую
центрифужную пробирку Falcon 2095, Becton Dickinson).
3. Центрифугируйте немедленно в настольной центрифуге 5-10 мин прн 1000 g
(максимальная скорость, рекомендуемая для центрифугирования пробирок Л°
2095-3600 об/мин).
4. Сразу же, как только закончится центрифугирование, перенесите плазму в
стерильную пластиковую пробирку (Falcon № 2001), воспользовавшись
пастеровской пипеткой.
5. Оставьте пробирку с плазмой для свертывания. (Если плазма находится в
гладкостенной пластиковой пробирке, это произойдет через несколько часов.
Процесс можно ускорить, использовав чистую стеклянную пробирку или
опустив в пластиковую пробирку конец стерильной стеклянной пастеровской
пипетки.)
6. Уберите фибриновый сгусток после перемешивания плазмы стерильной
стеклянной пастеровской пипеткой.
7. Инактивируйте нагреванием в водяной баие при 56 °С в течение 30 мин.
8. Профильтруйте образец через стерильный фильтр Millex-GS 0,22 мкм
(Millipore Ltd), ие забывая отбросить первые несколько капель (~0,5 мл)
образца.
9. Распределите аликвоты в стерильные пластиковые пробирки. Заморозьте
для использования в будущем.
очистки воды, которой располагает лаборатория, ее лучше покупать. Вода
Предыдущая << 1 .. 137 138 139 140 141 142 < 143 > 144 145 146 147 148 149 .. 162 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed