Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Манк М. -> "Биология развития млекопитающих " -> 142

Биология развития млекопитающих - Манк М.

Манк М. Биология развития млекопитающих — М.: Мир, 1990. — 406 c.
ISBN 5-03-001333-4
Скачать (прямая ссылка): biologiyarazvitiyamlekopitaushih1990.djvu
Предыдущая << 1 .. 136 137 138 139 140 141 < 142 > 143 144 145 146 147 148 .. 162 >> Следующая

столиком и термостатически регулируемым нагревательным блоком (ВТ1; Grant
Instrument) на 37 °С. Как только будет обнаружен ооцит, его следует
перенести в тест-пробирку со средой, забуференной HEPES (табл. 14.2) при
37°С для транспортировки в лабораторию.
4. Среды для культивирования эмбрионов и вымывания ооцитов
Принципы, лежащие в основе приготовления сред для культивирования
эмбрионов, детально изложены Праттом в гл. 2 (разд. 5). Мы опишем лишь
некоторые модификации, связанные со спецификой оплодотворения и
культивирования эмбрионов человека.
4.1. Ионный состав
Для оплодотворения ооцитов человека in vitro и культивирования эмбрионов
с успехом применяется ряд сред. Все они представляют собой модификации
сред, широко используемых для культивирования in vitro
предимплантационных эмбрионов и для роста клеточных линий, - это
сбалансированные солевые растворы Эрла (EBS) [13], раствор Тб Уиттингхэма
[14], В2 Менезо [15], F10 Хэма [16]. Применение названных сред
24*
364
Глава 14
дает приблизительно одинаковые результаты по оплодотворению и скорости
дробления.
Некоторые из основных сред можно приобрести в готовом виде - в жидком (в
десятикратной концентрации) или в форме порошка (EBS, F10 Хэма, Flow
Fabs). Однако многие исследователи предпочитают готовить среды
собственными руками, поскольку это дает возможность лично контролировать
каждый ингредиент [17]. Рецепты сред, основанных на EBS. представлены в
табл. 14.1-14.4. Следует тщательно проверить осмоляр-ность среды, она
должна находиться в пределах 280- 285 мОсмоль/л, иначе оплодотворение
может не произойти.
4.2. Макромолекулы
Во многих лабораториях, где проводят в терапевтических целях
оплодотворение in vitro, к среде для оплодотворения и роста добавляется
сыворотка крови матери. Вопрос о необходимости присутствия макромолекул в
культуральной среде был поставлен недавно [18], хотя соответствующие
эксперименты на мыши свидетельствовали об этом.
Концентрация сыворотки, используемой для оплодотворения у человека,
варьирует от 7,5 до 10%, а для культивирования--от 10 до 15% [13-17].
Приготовление сыворотки, необходимой для оплодотворения in vitro,
культивирования и переноса эмбрионов, описано в табл. 14.4. Следует
учесть, что добавление сыворотки крови к среде создает трудности при
сравнении результатов, поскольку среда не имеет определенного состава. В
попытках решить эту проблему в нашей лаборатории мы стандартизировали
среду для оплодотворения, заменив сыворотку крови матери 5 мг/мл фракции
5 БСА (BSA; Sigma А9647). БСА можно приобрести в большом объеме и хранить
замороженным в течение, ряда лет. Оплодотворение в этой среде, как
правило, проходит успешно, и оплодотворенные таким образом ооциты дают
начало беременности.
Среды для роста ранних эмбрионов стандартизировать трудно, так как БСА
может обеспечивать развитие до стадии бластоцисты [19]. С успехом
использовались как смешанная сыворотка крови, так и смешанная сыворотка
спинномозговой жидкости, однако, поскольку существует риск переноса
заболеваний, использовать эти эмбрионы для имплантаций не рекомендуется,
за исключением случаев, когда сыворотка должным образом экранирована.
4.3. Вода
Наиболее уязвимыми ингредиентами систем культивирования
предимплантационных эмбрионов являются вода и масло. По нашему убеждению,
независимо от качества установки для
Таблица 14.1. Ингредиенты, входящие в состав сбалансированного солевого
раствора Эрла для оплодотворения in vitro и культивирования эмбрионов
человека
EBS, Х10
Вода
Бикарбонат натрия Пируват натрия
Пенициллин
Гентамицин
Гепарин
БСА, фракция 5 HEPES
Сбалансированный солевой раствор Эрла, в 10-кратной концентрации, без
бикарбоната натрия (Flow Labs)
Подходящая для культуры ткани Analar (BDH) или вода для инъекций, В. P.
(Boots Hospital Products)
(BDH : Analar grade)
(Sigma Chemical Co.) основной раствор 1,1 мг/мл;
заморозьте аликвоты по 1 и 4 мл Cristapen (Glaxo Ltd), виалы иа 600 мг.
Храните в морозильнике. Разводите 1 мл ультрачнс-той воды для культуры
тканей до 600 мг/мл Garamycin (Schering), изготовитель Flow Labs,
поставляется в виде основного раствора 10 мг/мл
Mucous Heparin, без консерванта (Paynes and Byrne Ltd). Ампулы 0,2 мл,
содержащие 5000 ME. Храните в морозильнике Bovine Serum Albumin Powder
Fraction V (Sigma, Кат. № A9647)
Свободная кислота; (Ultrol, Calbiochem). Исходный раствор 21 мМ. (5,96
г/100 мл). pH довести 0.2 М NaOH до 7,35-7,4. После приготовления можно
хранить до 3 мес
Таблица 14.2. Среда для промывания фолликулов и работы с эмбрионами (EBS,
забуференный HEPES, для использования на воздухе)
Для приготовления 400 мл EBS, забуференного HEPES (HEBS) без антибиотика:
1. Разморозьте одну 4-мл аликвоту пнрувата натрия (табл. 14.1).
2. Взвесьте 0,1348 г бикарбоната натрия. Добавьте 20 мл воды и
растворите.
3. Отмерьте 40 мл десятикратного EBS в коническую колбу. Добавьте 295 мл
воды и оттаявшую аликвоту пнрувата натрия.
Предыдущая << 1 .. 136 137 138 139 140 141 < 142 > 143 144 145 146 147 148 .. 162 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed