Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Манк М. -> "Биология развития млекопитающих " -> 136

Биология развития млекопитающих - Манк М.

Манк М. Биология развития млекопитающих — М.: Мир, 1990. — 406 c.
ISBN 5-03-001333-4
Скачать (прямая ссылка): biologiyarazvitiyamlekopitaushih1990.djvu
Предыдущая << 1 .. 130 131 132 133 134 135 < 136 > 137 138 139 140 141 142 .. 162 >> Следующая

способствует регуляции метаболизма перед переносом эмбрионов и повышает
долю нормально разсиваклцих-ся плодов. Замедления развития можно избежать
и в том случае, если переносить реципиенту сразу же после оттаивания 8-
клеточные эмбрионы. Между тем в случае бластоцист асинхронный перенос без
предварительного культивирования (сразу после оттаивания) не ускоряет
замедленного темпа развития [29, 30].
6.3.1. От 1-клеточиой до 8-клеточиой стадии
После удаления ДМСО просмотрите эмбрионы в препаровальном микроскопе и
классифицируйте их в соответствии со следующими критериями.
1. Нормальные (внешний вид такой же, как у не замораживавшихся эмбрионов
соответствующей стадии развития).
2. Бластомеры разбухли.
3. Один или более бластомеров подверглись лизису.
4. Дегенерировали.
5. Блестящая оболочка утрачена или разорвана.
350
Глава 13
Вероятность того, что нормальные эмбрионы возобновят развитие в культуре,
высока. Разбухание бластомеров свидетельствует о том, что в клетках
осталось некоторое количество ДМСО, или транспорт через мембрану нарушен.
Разбухшие эмбрионы могут "оправиться", но некоторые лизируют. Способность
поврежденных эмбрионов продолжить нормальное развитие зависит от стадии,
на которой они были заморожены, и от числа поврежденных бластомеров.
Потеря одного бластомера на 2-клеточной стадии обычно оказывается
летальной, и лишь немногие из поврежденных 4-клеточных эмбрионов способны
сформировать нормальную бластоцисту. 8-Клеточные эмбрионы после утраты
одного или двух бластомеров сформируют бластоцисту с уменьшенным числом
клеток внутренней клеточной массы и смогут развиваться дальше после
переноса. Эмбрионы ранних стадий развития (<8 клеток) плохо развиваются в
культуре без блестящей оболочки, их не следует переносить в яйцевод, пока
не пройдет стадия компактизации. Эмбрионы поздних стадий развиваются
нормально без оболочки так же, как и эмбрионы всех стадий, оставшиеся
внутри разорванной оболочки. Однако в отсутствие интактной блестящей
оболочки возрастает риск вирусной инфекции [31].
6.3.2. Бластоцисты
Сразу после оттаивания бластоцисты могут деформироваться, затрудняя
морфологическую оценку. Полностью дегенерировавшие эмбрионы
отбрасываются.
6.3.3. Развитие in vitro
Оттаявшие эмбрионы промывают в среде М16+БСА (гл. 2, разд. 5.2) и
культивируют в течение ночи в каплях той же среды под маслом. Эмбрионы,
возобновившие нормальное дробление, н бластоцисты, восстановившие форму,
переносят в яйцеводы псевдобеременных реципиентов дня 1 (стадии от 2-
клеточной до бластоцисты) или в матку (стадии морулы и бластоцисты)
(разд. 6.4).
6.4. Перенос эмбриона
Для того чтобы развитие эмбрионов завершилось рождением живых детенышей,
зародыши предимплантационных стадий должны быть перенесены в организм
псевдобеременной приемной матери. Перенос можно осуществить с помощью
хирургических методов (в яйцевод или матку) и нехирургической процедуры
(см. работы [32, 33]). К сожалению, в последнем
Низкотемпературная консервация яиц н эмбрионов мыши_____________351
случае мы не можем предсказать, в каком именно роге матки будет
развиваться зародыш. К тому же этим методом трудно овладеть. Здесь мы
описываем суть операций по имплантации эмбрионов в яйцевод (разд. 6.4.5.)
и матку (разд. 6.4.6).
6.4.1. Приемные матери
Для обычного переноса эмбрионов мы предпочитаем брать в качестве приемных
матерей гибридных самок Fi (т.е. C57BL/6JXCBA/Ca или C57BL/6XCBA/H),
характеризующих-ся более чем 90%-ной псевдобеременностью после спаривания
со стерильным самцом и наступлением беременности после переноса.
Аутбредных мышей (т.е. MF1; Harlan-Olac Ltd, Bicester, Англия) можно
использовать; инбредных линий следует избегать. Мыши должны быть в
возрасте по крайней мере 12 нед и весом 20 г и более.
6.4.2. Индукция псевдобеременноети
Псевдобеременность индуцируется спариванием самок, находящихся в
соответствующей стадии естественного цикла, с вазэктомированным самцом
(гл. 1, разд. 5.3) или с самцом, обладающим естественной стерильностью,
т.е. несущим транслокацию Т145Н [34]. Для того чтобы получить подходящего
реципиента в данный день, отберите для спаривания самок в проэструсе или
воспользуйтесь эффектом Уиттена (см. гл. 1, разд. 5.2). Синхронизация с
помощью экзогенных гонадотропинов снижает пропорцию самок, у которых
спаривание индуцировало псевдобеременность.
6.4.3. Число эмбрионов
Обычно переносится от трех до шести эмбрионов в каждый яйцевод или рог
матки (т.е. общее число эмбрионов - 6-12 на реципиент). Если использовать
меньшее их число, беременность может не установиться, кроме того, у очень
маленького приплода меньше шансов выжить. Перенос слишком большого числа
эмбрионов приведет к замедлению их роста.
6.4.4. Анестетики
Реципиентов анестезируют за несколько минут до операции 1,2%-ным
раствором авертина (гл. 1, разд. 5.5), инъецированным внутрибрюшинно в
дозе 0,02 мл на г веса тела.
352
Глава 13
Таблица 13.10. Подготовка псевдобеременного реципиента к переносу
Предыдущая << 1 .. 130 131 132 133 134 135 < 136 > 137 138 139 140 141 142 .. 162 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed