Биология развития млекопитающих - Манк М.
ISBN 5-03-001333-4
Скачать (прямая ссылка):
криоконсервации, характеристика сохраняемой линии мышей, номер
ампулы/пайе-ты, число ооцитов/эмбрионов на ампулу/пайету, стадия
развития, метод консервации, т. е. замораживание или витрификация,
местонахождение в хранилище ЖА, необходимый способ размораживания и
процедура разбавления.
В случае замороженных эмбрионов необходимо также зафиксировать сведения о
замораживающей среде, объеме образца, конечной концентрации ДМСО,
скорости охлаждения, конечной температуре перед погружением в ЖА.
Для витрифицированных эмбрионов обязательно укажите характеристику
витрификационного раствора.
5.3. Номенклатура
До сих пор не получено данных, свидетельствующих о том, что мыши,
происходящие из замороженных эмбрионов, оказались генотипически или
фенотипически измененными в результате процессов замораживания и
оттаивания. Остается убедиться в отсутствии каких-либо генетических
изменений эмбрионов после витрификации. Нужно учитывать, что фенотип
может быть модифицирован внутриматочным окружением, вследствие чего
Низкотемпературная консервация яиц и эмбрионов мыши
345
эмбрионы, развивающиеся в приемных мышах родительской линии, могут
отличаться от эмбрионов, полученных от реципи-ентной линии. Важно знать
историю подопытных животных; вот почему вся информация, имеющая к ней
отношение, также должна быть включена в описание сохраняемого материала.
Описание сохраняемого материала инбредных линий мышей, получаемых из
замороженных эмбрионов, регламентируется международными правилами [28].
Вопрос о номенклатуре материала, сохраняемого путем витрификации, еще не
рассматривался.
6. Оценка жизнеспособности консервированного материала
Число сохраняемых яиц или эмбрионов, представляющих каждую линию мышей,
зависит от потребностей лаборатории. Чтобы точно определить, сколько
яиц/эмбрионов необходимо для консервации, нужно оценить выживаемость
каждой законсервированной партии. Методика в данном случае идентична той,
что используется для живых мышей, за исключением того, что приемная мать
может быть забита на поздних стадиях беременности (день 15-16) для
подсчета числа нормальных плодов. При оценке числа эмбрионов,
обеспечивающих сохранение линии, нужно учитывать и возможность
постнатальной потери животных.
6.1. Ооциты
После отмывки от ДМСО оттаявшие ооциты или кумулюс-ные массы можно
переносить в яйцеводы самок, предварительно (за 2-4 ч) спаренных с
фертильными самцами [3]. Выживаемость повышается, если ооциты
оплодотворяют in vitro и переносят на 2-клеточной стадии в яйцеводы
псевдобеременных реципиентов дня 1 (разд. 6.4.5).
6.2. Оплодотворение in vitro
Процедуры, которые, судя по нашему опыту, оказались наиболее удачными при
оплодотворении оттаявших ооцитов in vitro, обобщены в табл. 13.7 и
детально описаны ниже.
6.2.1. Среды
Спермин собирают и диспергируют в модифицированном растворе Тироде (Тб:
15, табл. 13.8). Для капаситации спер-миев и оплодотворения среду
обогащают 15 мл/мл БСА, Sigma, Fraction V (Т6 + БСА).
23-171
346
Глава 13
Таблица 13.7. Оплодотворение in vitro оттаявших ооцитов мыши
(см. разд. 6.2)
Инкубацию проводите при 37 °С в увлажненной атмосфере с 5% СО;
в воздухе.
А. День накануне оплодотворения in vitro
1. Внесите пипеткой по 1 мл среды Тб (табл. 13.8) в две пластиковые чашки
Петри Falcon или в два эмбриологических часовых стекла. Поверх наслоите
парафиновое масло. Инкубируйте в течение ночи. Эти камеры будут
использованы для начальной дисперсии спермы.
2. Добавьте БСА (Sigma, Fraction V, 15 мг/мл) к Тб (T6-FБСА),
стерилизуйте фильтрованием и инкубируйте всю ночь.
Б. В день оплодотворения in vitro
1. Отрегулируйте pH среды Т6+БСА до 7,5-7,6, приготовьте капли среды для
оплодотворения (разд. 6.2.2) и инкубируйте.
2. Соберите сперму в капли Тб, приготовленные в п. А1 (выше), и
инкубируйте (разд. 6.2.3).
3. Через 25 мин в каждую каплю внесите пипеткой аликвоту хорошо
диспергированных подвижных спермиев, чтобы конечная концентрация
составляла 1-2х10б спермиев/мл. Инкубируйте.
4. Разморозьте ооциты, проведите разбавление ДМСО (разд. 3.6) и отмойте в
М2. Держите на воздухе на нагревательном столике при 37 °С.
5. Через 2 ч после сбора спермы промойте ооциты в Тб+БСА и перенесите в
капли для оплодотворения (разд. 6.2.4). Инкубируйте.
6. Примерно через 4 ч соберите ооциты, промойте в среде М16+БСА (см. гл.
2, разд. 5.2) и инкубируйте всю ночь в каплях среды М16+БСА под маслом
(разд. 6.5.2).
7. Примерно через 20 ч инкубации имплантируйте эмбрионы на 2-клеточной
стадии в М2 псевдоберемеиным самкам дня 1 (см. разд. 6.4.5).
6.2.2. Приготовление капель для оплодотворения
Для оплодотворения ооциты, свободные от клеток кумулюса, или интактные
кумулюсные массы инкубируют с капасити-рованными спермиями в каплях Тб +
БСА под парафиновым маслом. Приготовьте капли следующим образом.
1. Инкубируйте Тб+БСА в течение ночи прн 37 СС в атмосфере с 5% СО2 в
воздухе.
2. На следующий день доведите pH среды до 7,5-7,6 с помощью 0,1 М NaOH.
