Биология развития млекопитающих - Манк М.
ISBN 5-03-001333-4
Скачать (прямая ссылка):
фаговом векторе, как Kgt 11 [23].
4.2. Синтез и клонирование двухцепочечных кДНК
Для синтеза двухцепочечных кДНК предложено несколько методик [11, 23, 25,
26]; можно пользоваться любой из них. Мы рекомендуем метод Уотсон и
Джексона [11], включающий оригинальный способ синтеза второй цепи ДНК,
который разработан Окаямой и Бергом [27]. Он заключается в том. что
гибридный продукт мРНК/кДНК. полученный в результате реакции синтеза
первой цепи, обрабатывается РНКазон Н, чтобы получить короткие фрагменты
РНК, служащие затравкой для ДНК-полнмеразы 1 Е. coli, которая будет
синтезировать вторую цепь кДНК и замещать РНК на ДНК. Цепи сшиваются ДНК-
лигазой Е. coli. Этот подход благоприятствует синтезу полноразмерной кДНК
и снижает возможность потерь и артефактов (таких, как присутствие кДНК,
неколчнеарных мРНК в области 5'-конца). Эти проблемы часто возникают при
использовании альтернативного подхода, включающего обработку нуклеазой S1
[28], специфичной к одноцепочечпым молекулам.
На рис. 9.1 представлена схема синтеза и клонирования кДНК. Если
количество исходных полиаденилированных РНК меньше 1 мкг, в протокол
следует ввести две модификации.
Библиотека кДНК для предимплантационного эмбриона мышн
247
КЛОНИРОВАНИЕ кДНК в Xgt 10 мРНК 5'---------Ап 3'
Гибрид мРНК/кДНК !
Репарация ris-кДНК ^
Обратная транскриптаза oligo <dt) 12 - 18 An 3'
Тп 5'
ДНК-попимераза I, РНКаза Н, Лигаза E.cofi - Тп 5'
Ап 3'
ДНК полимераза Т4
Тп
Ап
Метилаза Eco R1
М
Линкеры ?coR1
ООО 00000 + ?
М'
?coR1
м
Удаление
линкеров
R1
Xgt 10
Eco R1
Л /
Лигирование
Упаковка
Рекомбинантный Xgt 10
Рис. 9.v ''.иитез и клонирование двухцепочечных кДНК в векторе
бактериофага XgtlCk. Детали описаны в работе [11].
1. Как уже отмечено в разд. 3.4, вирусный носитель (CPMV) должен быть
добавлен к образцу РНК перед отделением poly(A)+-PHK.
2. Аликвота РНК CPMV в 1 мкг должна быть добавлена к двухцепочечной ДНК с
присоединенными линкерами, перед хроматографией на колонке с ультрагеле.м
(удаляющей избыток линкеров), чтобы предотвратить потери кДНК,
обусловленные неспецифическим связыванием с матриксом колонки.
Все манипуляции с ДНК необходимо проводить в силиконн-рованных
микроцентрифужных пробирках. Кроме того, на стадии колоночной
хроматографии (для удаления линкеров Eco R1, рис. 9.1) и колонка, и
стекловолокнистая прокладка должны
248
Глава 9
Гуч
г. ¦•
'#
У ', > " ; г , , .-
•-•у '-• ---у. кЧЧ Ло :>. • •-/- ., •
Л-у . чч -i-у у. > •-
¦:V'.У У ' *'• • •
• s '.г.
, Л';УУ •! кУс-.У . • j
I . .... .......................v
ЬУ- •- #
*
* • * • •: " •*
1 . '.-У ¦ - .
~ * м
¦: ¦ ajp-- .-• • ' ¦ -
Ш
ррь
4' '5:
л. **. •*>
Рис. 9.2. Гибрнднзацнонный паттерн, полученный в результате гибридизации
нитроцеллюлозного фильтра, несущего 65 бляшек библиотеки кДНК ооци-
та/CPMV (1 : 19), с радиоактивным зоидом CPMV. Число гибридизоваиных
бляшек - 40, что очень близко к ожидаемому - 46 (65 минус 16
нерекомбинантных бляшек фона н 3 ооинт-спецнфическнх клона, см. работу
[19]).
быть силиконированы. Для этого пробирки и стеклянное оборудование
несколько раз споласкивают в 2%-ном растворе дихло-родиметилсилаиа в
1,1,1-трихлороэтане (поставщики Hopkin and Williams), а затем в
стерильной дистиллированной воде, после чего автоклавируют. Не забывайте
о технике безопасности: этот раствор токсичен.
Упаковка гибридной ДНК фага in vitro должна производиться в соответствии
с указаниями изготовителя (Amersham, Giga-pack), посев фага следует
проводить в соответствии с рекомендациями работы [23]. Для ценных
образцов упаковочные экстракты необходимо предварительно проверить.
Чтобы оценить представительность библиотек в отношении интересующей нас
РНК, следует предусмотреть ряд контрольных процедур. Известно, что среди
фаговых бляшек неизбежно
Библиотека кДНК для предимпланташюнного эмбриона мыши
249
присутствуют нерекомбинантные (фон). Для определения их частоты
необходимо лигировать вектор Xgt. Число клонов CPMV можно оценить путем
скрининга библиотеки радиоактивным зондом, полученным нз РНК CPMV с
использованием обратной транскриптазы и случайных затравок из тимуса
теленка (см. табл. 9.3,В). Для подсчета эмбрионоспецифических
рекомбинантов необходимо из общего числа бляшек вычесть то количество,
которое соответствует фону и CPMV. На рис. 9.2 представлен
нитроцеллюлозный фильтр, приготовленный из библиотеки ооцита мыши и
гибридизованный с зондом CPMV Исходя из среднего размера обеих РНК CPMV
(4,7 т. п. н) (он более чем вдвое превышает среднюю эукариотическую
мРНК), число молекул CPMV на грамм должно быть меньшим такового для
эмбриональной РНК, следовательно, число эмбриональных клонов в
действительности выше.
В следующем разделе описаны различные процедуры, которыми можно
пользоваться для выделения интересующих клонов из библиотеки кДНК.
5. Скрининг библиотеки
Обычно скрининг библиотек кДНК осуществляется гибридизацией радиоактивных
проб (зондов) нуклеиновой кислоты с фаговой ДНК, нанесенной на
