Биология развития млекопитающих - Манк М.
ISBN 5-03-001333-4
Скачать (прямая ссылка):
роста и развития зародышей в культуре требуются некие специфические
факторы, содержащиеся в репродуктивном тракте.
3. Культивирование эмбрионов предполагает необходимость тщательных и
регулярных наблюдений. Только при этих условиях можно овладеть данной
методикой, научиться отличать нормальное развитие от аномального и
определять нужную стадию развития эмбриона.
2. Извлечение эмбрионов
Извлечение и культивирование эмбрионов не обязательно проводить в
стерильных условиях, нужно лишь обеспечить чистоту и отсутствие пыли.
Поскольку культуры поддерживаются не более 4-5 суток, в качестве мер,
предохраняющих от бактериального заражения, вполне достаточно того, чтобы
все ма-
1 Н. Р. М. Pratt. Embryo and Gamete Research Group, Department of Ana
tomy, University of Cambridge, Downing Street, Cambridge CB2, 3DY, UK.
¦28
Глава 2
нипуляции проводились в стерильной среде при помощи вытянутой в пламени
стеклянной пипетки и под микроскопом, защищенным от пыли специальным
чехлом. Подробности о реактивах, средах и оборудовании см. в разд. 5.
Яйцеклетки и эмбрионы (особенно на одно- и двухклеточной стадиях
развития) чрезвычайно чувствительны к внешним воздействиям. Между тем при
культивировании часто оказывается необходимым извлекать эмбрионы из
инкубатора для наблюдений. Наиболее очевидное следствие возникающих при
этом температурных сдвигов - удлинение периодов G2 и М клеточного цикла
[3J. Один из способов избежать неприятных последствий - использовать при
микроскопировании нагревательный столик, отрегулированный на 36±1°С и
среду, нагретую до 37°С.
Общепринятой оптимальной культуральной среды нет; состав сред,
применяемых в разных лабораториях, варьирует. Обязательными компонентами
во всех случаях служат содовый буфер, лактат, пируват и бычий
сывороточный альбумин. Различия касаются концентраций этих и иных
компонентов и конечной осмолярности среды [4, 5].
Процедура извлечения эмбрионов в зависимости от стадии развития
отличается последовательностью операций. В общих чертах процесс
заключается в сборе зародышей в теплую (37 °С) забуференную HEPES среду,
содержащую БСА (М2 + + БСА) при помощи вытянутой в пламени пастеровской
пипетки, соединенной с мундштуком. Остаток клеток кумулюса и слизи
удаляют посредством нескольких переносов эмбрионов по ряду капель теплой
(37°С) культуральной среды М2 + БСА и последующего споласкивания в
культуральной среде Ml6 +БСА. В заключение эмбрионы помещают в капли М16
+ БСА (-• 50 мкл), находящиеся под легким парафиновым маслом в
пластиковых чашках Петри, и инкубируют при 37 °С в атмосфере 5%-ного СОг-
В интенсивно работающих лабораториях число таких чашек очень велико. В
этом случае удобно устанавливать чашки на узкие подносы Регрех,
увеличивающие глубину инкубатора. Если необходим частый доступ к
эмбрионам, удобно иметь второй инкубатор для кратковременного
культивирования, что дает возможность долговременным культурам находиться
в стабильных условиях.
2.1. Оплодотворенные и неоплодотворенные яйцеклетки
2.1.1. Спаривание in vivo
Спаривание после естественной или экспериментально индуцированной
овуляции (суперовуляции) описано в разд. 1.5 (гл. 1). По нашим данным,
самцы-производители функциони-
Эксперименты с предимплантацнонными эмбрионами мыши___________29
руют наиболее эффективно в случае регулярных спариваний, но не чаще, чем
через ночь. Суперовуляция - удобный прием для получения большого числа
яйцеклеток и эмбрионов от молодых (3-4 недели) мышей [6]. Для эффективной
синхронизации оплодотворения и развития применяют гормональную
стимуляцию. Соответствующая схема инъекций представлена в разд. 5.4 (гл.
1). Отклонения от нее обеспечивают асинхрон-ность развивающейся популяции
(если в эксперименте требуются эмбрионы разного возраста). Важно быть
уверенным в том, что из суперовулировавших яиц развиваются нормальные
эмбрионы. Чтобы убедиться в этом, при сравнении таких эмбрионов с
контролем (т. е. с эмбрионами, развившимися из яиц, овули-ровавших
естественным образом) следует использовать надежные критерии.
Для получения оплодотворенных или неоплодотворенных яйцеклеток проделайте
следующие процедуры.
1. Забейте самку смещением шейных позвонков, отпрепарируйте яйцеводы и
поместите их в теплый (37 °С) физиологический раствор или среду М2 + БСА
(разд. 5). Все манипуляции с яйцеводами производите в пластиковых чашках
Петри или в стеклянных камерах на нагревательном столике бинокулярного
микроскопа. Если овуляция произошла в течение предшествующих 10 ч
(приблизительно), массы клеток кумулюса, окружающие яйцо, будут хорошо
видны через тонкие стенки ампулы.
2. Отделите кумулюсные массы в культуральной среде М2 + + БСА с помощью
тонкого глазного пинцета.
3. Удалите как можно больше среды (но не понижайте мениск настолько,
чтобы он сдавил яйца) и замените ее приблизительно 1 мл теплого раствора
( + 37°С) гиалу-ронидазы (табл. 2.4). В течение следующих 2-4 мин клетки
