Микробный синтез на основе целлюлозы: белок и другие ценные продукты - Лобанок А.Г.
ISBN 5-343-00283-8
Скачать (прямая ссылка):
Присутствие множественных форм целлюлаз в культуральной жидкости Trichoderma reesei и других организмов наблюдали и многие другие исследователи, однако происхождение этих форм не нашло удовлетворительного объяснения. Точка зрения о том, что множественность форм целлюлаз объясняется модификацией основных ферментов протеазами культуральной жид-
46
кости, не разделялась всеми исследователями. Теоретически множественность молекулярных форм ферментов может быть следствием ряда событий (Kammel, Kubicek, 1985): недостаточной точности трансляции или гликозилирования, модификации в течение или после транспорта через цитоплазматическую мембрану, постсекреционной модификации белковой или углеводной структуры, образования фермент-субстратных или фермент-фер-ментных агрегатов или даже комбинации их. Кроме того, не исключено существование истинных изоферментов, закодированных различными структурными генами. В исследовании Kammel и Kubicek (1985) выявлено, что множественные формы целлюлаз появляются очень рано при глубинном культивировании Trichoderma reesei, но некоторые из них инактивируются в процессе длительного культивирования.
Методом изоэлектрического фокусирования и окрашивания белков и гликопротеинов было показано, что внеклеточные белки состоят из ряда компонентов, идентичных на всех стадиях культивирования. Аналогичные результаты получены и для глико-протеинов. Состояние гликозилирования р-глюкозидазы в процессе культивирования также не изменяется. Инкубация in vitro культуральной жидкости Trichoderma reesei без добавления и с добавлением изолированных клеточных стенок гриба выявила только минорные изменения в профиле белков при изоэлектрофокусировании. Авторы на основании полученных данных сделали заключение о том, что протеины и гликопротеины из Trichoderma reesei, растущего на целлюлозе, секретированные в культуральную жидкость, не подвержены постсекреторной модификации.
Таким образом, различные химические и физические воздействия, ведущие к возникновению новых молекулярных форм, должны, по-видимому, осуществляться на более ранних стадиях секреции. Среди возможных причин образования множественных форм целлюлаз — наличие подлинных изоферментов, кодируемых отдельными генами и выполняющих различные функции, неодинаковые способы сплайсинга мРНК, транскрибируемых с одного гена, комплексирование с индивидуальными углеводными компонентами, ассоциация белков и диссоциация надмолекулярных образований, модификация ферментного белка протеолити-ческими ферментами и, наконец, воздействие физико-химических факторов среды при соответствующих условиях культивирования микроорганизма-продуцента. Множественность компонентов, кроме того, может выступать как артефакт в процессе выделения ферментов (Рабинович,1987).
Большинство сообщений относительно ингибирования целлюлаз касается ингибирования тяжелыми металлами, избытком субстрата, конечным продуктом, физическими и химическими факторами. Природными ингибиторами целлюлаз являются фенольные соединения, танины.
47
В литературе отмечается стимулирующее (защитное) действие на целлюлазы некоторых белков и красителей, цистеина и аскорбиновой кислоты. Мочевина увеличивает скорость инактивации фермента, однако в кислой среде отрицательный эффект в основном компенсируется за счет стимуляции фермента путем уменьшения ингибирования (Datta et al., 1961). Ингибирующее действие некоторых реагентов объясняют связыванием тиоловых групп активного центра молекул фермента (Sison et al., 1952; Bull, 1967; Pathak, Ghose, 1973) Бутанол, этанол и глюкоза являются сильными ингибиторами деллюлазы, органические кислоты целлюлазу Trichoderma reesei практически не ингибируют. Ацетат и бутанол необратимо инактивируют целлюлазу (Takagi,
1984).
Гемицеллюлазная и пектолитическая активность в меньшей степени лимитируют способность ферментных препаратов расщеплять лигноцеллюлозные субстраты. На среде с целлюлозой или ксиланом Trichoderma reesei продуцируют внеклеточные ферменты, которые могут гидролизовать и целлюлозу и ксилан. При низком насыщении среды кислородом образование р-глюкозидазы подавляется на среде с целлюлозой, но не на ксилане (Robinson, 1984). Poutanen et al. (1986) показано, что гемицел-люлазы Trichoderma reesei более активны, чем гемицеллюлазы Aspergillus awatnori. Авторы полагают, что гидролиз гетерокси-ланов различного происхождения представляет собой результат действия нескольких ферментов с неодинаковой активностью. С использованием электрофореза установлено, что культуральная жидкость Trichoderma reesei (Lappalainen, 1986) содержит три ксиланазы и две р-ксилозидазы. Основными продуктами деградации ксилана являются ксилобиоза и ксилоолигомеры. Добавление р-ксилозидазы усиливает образование ксилозы, но не влияет на общий гидролиз ксилана. Однако гидролиз ксилана усиливается при добавлении а-глюкуронидазы из Agaricus bisporus (Puls et al., 1986). Гемицеллюлазы Trichoderma reesei обладают большей дезаиелирующей активностью, чем гемицеллюлазы Aspergillus awamori. Предполагается, что триходермы в отличие от аспергиллов образуют а-1,2-глюкуронидазу (Poutanen et al., 1986). Показано также, что полиферментный комплекс Trichoderma reesei гидролизует р-1,4-маннозидные связи в полисахаридах (Власенко и др., 1985).
