Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Лефковитса И. -> "Иммунологические методы исследований" -> 85

Иммунологические методы исследований - Лефковитса И.

Лефковитса И., Перниса Б. Иммунологические методы исследований — М.: Мир, 1988. — 530 c.
ISBN 5-03-0011-70-6
Скачать (прямая ссылка): immunologicheskiemetodi1988.djvu
Предыдущая << 1 .. 79 80 81 82 83 84 < 85 > 86 87 88 89 90 91 .. 239 >> Следующая

Типирование тканей
227
одинаково связываются и в тех и в других условиях. Исходя из этого, мы предпочитаем работать при комнатной температуре. В большинстве случаев равновесие достигается через несколько минут, и дополнительная инкубация не меняет результатов. Некоторые антитела для достижения максимального связывания требуют большего времени. Проводили инкубацию различной продолжительности: от 1 до 3 ч, а также в течение ночи на холоду, и почти во всех случаях результаты были примерно одни и те же.
После инкубации суспензию разбавляют 1 мл охлажденного во льду БСА-буфера и немедленно центрифугируют в течение 1 мин. Супернатант отбрасывают и осадок быстро промывают еще 1 мл БСА-буфера. При этой промывке нет необходимости ресуспендировать клетки. Затем к каждому осадку в пробирке добавляют одну каплю (— 50 мкл) БСА-буфера (*) и осадки переносят во флаконы для сцинтилляционного счетчика, используя эппендорфовскую пипетку на 100 мкл. В контрольные флаконы (для счета фона) вносят одну каплю БСА-буфера. После этого во все флаконы (включая контрольные) приливают по 1 мл Soluene 350 для того, чтобы переварить клетки и сгустки материала, а также чтобы водный раствор, в котором содержится образец, хорошо перемешивался со сцинтиллятором. Флаконы закрывают крышками и инкубируют (*) при 37°С 1 ч на шей-кере при медленном встряхивании.
Переваренные образцы охлаждают (*), в каждый флакон добавляют по 15 мл сцинтиллятора и образцы снова охлаждают (*). Soluene 350 при смешивании со сцинтиллятором дает очень высокий фоновый уровень счета. Фон исчезает по прошествии определенного времени и при охлаждении. Этот эффект зависит от качества толуола в сцинтилляторе. Обычно для снижения фона достаточно инкубации флаконов в течение 1 ч при 4°С. Когда фон становится ниже 50 имп/мин, можно измерять образцы на сцинтилляционном счетчике. Обычное время счета— 1 мин/образец; окна счетчика устанавливают для регистрации 3Н или 14С.
VI. ПРИМЕНЕНИЕ И ОГРАНИЧЕНИЯ МЕТОДА
В принципе описанный здесь метод может быть использован для любого поверхностного антигена и любых моноклональных антител. На практике применение метода лимитируется аффинностью антител и чистотой встречаемости антигена на поверхности клетки. В случае применения антител IgM, которые трудней получать в чистом виде, чем IgG, а также при работе с клетками-мишенями, содержащими большое количество Fc-рецепторов, например со спленоцитами, могут возникнуть
15*
228 Глава 12
Таблица 12-2. Результаты теста связывания при исследовании экспрессии новых типов Н-2-антигенов в трансфецированных фибробластах
Трансфецированные фибро- Меченные 3Н-лейцнном связанные антитела1),
бласты Н-аш/? нмп/мнн на 10“ клеток*). ®)
34-4-21 28-14-8 34-2-12
d ) d ) ('V’2ataHTH-DWl7^
(ц.антн-D Су2а,анти-Ь
Эксперимент 1 1044 5360
Контроль НИ
H-2Dd 4848 ни 5482
Эксперимент 2 100 3772
Контроль 955
H-2Ld 1405 707 2942
') Ozato et al., 1980b, 1982.
2) НИ — не нсследовалнсь.
*) Подчеркнуты цифры, отвечающие специфическому связыванию.
серьезные проблемы, связанные с неспецифическим связыванием. Самые четкие результаты получают с лимфобластами, стимулированными Кон-А. При изучении клеток мышей нам удавалось получать хорошие результаты с моноклональными антителами против антигенов Н-2, la, TL, fcm, Thy-1, Ly-1 и Ly-2.
Описанный метод был применен для детектирования новых антигенов на фибробластах, трансфецированных клонированными Я-2-генами (табл. 12-2). Мы обычно используем этот метод для Н-2- и 1а-типирования стимулированных Кон-А спленоци-тов, которые также применяются как клетки-мишени для цито-токсических Т-клеток. Очень удобно, что эти клетки можно оставлять на холоду в течение ночи перед проведением теста связывания (табл. 12-3). Для стандартного Н-2- и 1а-типирова-ния мышей-беккроссов мы хирургически удаляем два или четыре шейных лимфатических узла и готовим клеточную суспензию. Эту суспензию можно разделить как минимум на пять порций в зависимости от набора моноклональных антител, которые будут использоваться для тестирования (если ожидают результат о наличии или отсутствии антигена, то нет необходимости считать клетки) (табл. 12-4).
При стандартных условиях (т. е. при стандартном типе и числе клеток, а также при стандартной концентрации антител) уровень связывания для определенного препарата моноклональных антител зависит от аллельной формы антигена, содержащегося на клетках. На основании таких данных можно достоверно различать высокий, промежуточный и низкий (или негативный)
Титрование тканей
229
Таблица 12-3. Результаты Н-2-тнпирования лимфобластов, стимулированных Кон-А, при исследовании свежевыделенных клеток или клеток после хранения в течение ночи на холоду
Предыдущая << 1 .. 79 80 81 82 83 84 < 85 > 86 87 88 89 90 91 .. 239 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed