Иммунологические методы исследований - Лефковитса И.
ISBN 5-03-0011-70-6
Скачать (прямая ссылка):
Эффективность преципитации буфером с низкой ионной силой, к сожалению, варьирует в значительной степени. Для многих IgM формируются осадки, содержащие почти всю активность антител. Из этих осадков получают препараты антител, дающие удовлетворительные результаты в тестах связывания (табл. 12-1), правда, не такие хорошие, как в случае IgG. Этим способом можно эффективно очищать также некоторые крысиные моноклональные антитела субкласса IgG2. Простота про-
Типирование тканей
225
Таблица 12-1. Тест связывания с использованием мышиных IgM-антител,
очищенных осаждением
Гибридона (специфичность Фракция Общая ра C57BL/6J AKR/J
синтезируемых антител)1) при осажде диоактив Thy-1.2. Thy-1.1,
нии в буфе ность, Ly-2.2 Ly-2.1
ре с низкой нмп/мин
ионной си
лой2)
НО-13.4.9 С (36) 14 004 2137®) 672
(анти-ТЬу-1.2) П (64) 15364 7365 345
HO-22.1 С (52) 16270 1918 2075
(анти-Thy-l.l) П (48) 16 604 627 4820
НО-2.2 С (50) 15 158 3091 1225
(анти-Ьу-2.2) П (50) 16 400 9783 633
1) Marshak-Rothstein et al., 1979; Gottlieb et al., 1980.
2) С — супернатант, П — преципитат. В скобках—доля (%) общей радиоактивности, содержащаяся в данной фракции.
3) Связанная с тимоцнтамн радиоактивность (нмп/мин); 1*10а клеток для антител анти-Thy-l и 1-I07 клеток для антител антн-Ьу-2. Подчеркнуты цифры, отвечающие специфическому связыванию.
цедуры диализа против буфера с низкой ионной силой в некоторой степени компенсирует тот недостаток, что в данных условиях осаждаются не все IgG. Непреципитированные антитела можно выделить из концентрированного супернатанта и очистить с помощью гель-фильтрации или на колонке с антителами, связывающими иммуноглобулины.
IV. АКТИВНОСТЬ И СТАБИЛЬНОСТЬ ПРЕПАРАТОВ АНТИТЕЛ
Все моноклональные антитела можно метить биосинтетическим способом без потери активности или специфичности. Для очищенных иммуноглобулинов доля радиоактивности, приходящаяся на антитела, способные связываться с антигеном, зависит прежде всего от того, синтезируют ли соответствующие гибри-домные клетки дополнительные тяжелые (их можно удалить) или легкие цепи миеломных родительских клеток и какова интенсивность этого синтеза. Как следует из наших данных, у нескольких гибридом, которые не синтезировали дополнительных цепей иммуноглобулинов, доля связывающихся с антигеном антител в очищенных препаратах иммуноглобулинов составляла более 90%.
Очищенные антитела могут храниться в течение очень длительного времени при 4°С с азидом натрия и БСА без какой-либо потери активности. Мы используем препараты, приготов-
15—1278
226 Глава 12
ленные 5 лет назад, и результаты, получаемые на них, со временем не ухудшаются. При хранении в течение двух лет примерно из 30 препаратов антител явно потерял активность только один. Этот же препарат характеризовался самым низким процентом связывающейся с антигеном активности и, возможно, содержал антитела, чувствительные к элюции кислыми растворами.
V. ТЕСТ СВЯЗЫВАНИЯ
1. Материал
БСА-буфер: ЗФР с добавлением 1% БСА и 0,2% NaNe
Сцинтиллятор: толуол+РРО+РОРОР (Pohlit et al., 1979)
Soluene 350 (Packard)
Оборудование: эппендорфовские пробирки на 1,5 мл с плот-ноприлегающими крышками, центрифуга (№ 5412), миксер (№ 5432) и мультипипетка (Multipette № 4780) фирмы Ерреп-dorf.
2. Проведение теста
Проведение этого теста может быть прервано на многих этапах (они отмечены звездочками в тексте), после чего материал хранят в течение ночи, обычно на холоду. Тест настолько воспроизводим, что мы обычно не считали нужным включать повторное исследование образцов. Вместо этого использовали три различных концентрации клеток или проводили отдельное тестирование на Н-2К и H-2D при типировании мышей, полученных возвратным скрещиванием (беккроссов).
Очищенные меченые антитела разводят БСА-буфером до требуемой активности. Мы обычно используем около 250000 имп/(мин-мл). Аликвоты разведенных антител хранят на холоду; они готовы к использованию в любое время.
Тестируемые клетки вносят в эппендорфовские пробирки — обычно в количестве (1-М0)-106 на пробирку. Если клетки еще не были переведены в малый объем (^25 мкл), то их осаждают центрифугированием в течение 1 мин, супернатант отбрасывают и во все пробирки добавляют по 100 мкл разбавленного раствора антител. Такое же количество этого раствора вносят во флакон сцинтилляционного счетчика (контроль вносимой с антителами радиоактивности). Пробирки закрывают и клеточные осадки ре-суспендируют на встряхивателе. Затем образцы инкубируют около 90 мин при комнатной температуре с периодическим встряхиванием (*). Некоторые антитела лучше связываются при 4°С, другие — при комнатной температуре, а ряд антител
