Иммунологические методы исследований - Лефковитса И.
ISBN 5-03-0011-70-6
Скачать (прямая ссылка):
¦3. Связывание с матрицей колонки и элюция
Все процедуры выполняются при комнатной температуре. Поскольку IgGi связываются с белком А только при pH выше <6,0 (Еу et al., 1978), культуральные жидкости, содержащие IgGi-антитела, следует перед нанесением на колонку доводить до pH 8,0 с помощью 1,0 М триса. Перед нанесением материала колонку промывают одним объемом 0,1 М триса, pH 8,0. При •очистке IgG2a, IgG2b и IgG3 культуральную жидкость наносят на колонку после того, как она достигла комнатной температуры и была подвергнута дегазации. При нанесении раствора со скоростью потока около 1 мл/мин собирают «проскок». Колонку промывают 10 мл (2 объема колонки) ГСР и после этого элюируют IgGi 10 мл 0,1 М цитрата натрия, pH 6,0. Часто имеет
4-
pH 6,0
pH 4,5 pH 3,0
О
я
II
Номер фракции 4 14
(имп/мин)- 10 ^
) Вносимая
радиоакти виость 26,7 20.0
Связалось с Н---2^ 8.6 6,3
Связалось с Н---2*3 6.9 1,1
Связалось с Н---2^ 9.4 0,4
Типироваиие тканей
223-
смысл включать эту процедуру и тогда, когда необходимые антитела относятся к другому подклассу, так как при этом отмываются связанные IgGi, синтезируемые миеломными клетками (которые используют при получении некоторых гибридом), а также большое количество немеченого материала (рис. 12-1). К сожалению, очистить препарат от иммуноглобулинов, которые содержат легкие цепи, синтезируемые миеломными клетками, гораздо сложнее.
IgG2a обычно легко элюируют 0,1 М цитратом натрия, pH 4,5 (Еу et al., 1978), но в большинстве случаев проще использовать
0,3 М глицин-НС1 (10 мл), pH 3,0, который элюирует также IgG2b и IgG3. Элюат собирают фракциями по 1 мл и немедленно нейтрализуют добавлением 1,0 М триса, pH 9,0. Значения pH удобней всего измерять с помощью узких полосок индикаторной бумаги (Neutralit, Merck, № 9564). После этого колонку снова промывают 5 мл ГСР, повторяют элюцию 5 мл 0,5 М глицин-НСЬбуфером, pH 3,0, и, наконец, перед хранением промывают еще раз большим объемом ГСР.
Следует помнить о том, что характеристики связывания и элюции для различных иммуноглобулинов могут варьировать и не всегда предсказуемы в соответствии с их классом. Некоторые ^Огь-антитела удавалось смыть с колонки только с помощью
0,3 М глицин-НСЬбуфера, pH 2,5, или 0,5 М глицин-НС1-буфера, pH 3,0. Поэтому при работе с новыми антителами необходимо' сохранять «проскок», а также тестировать элюат, полученный при промывке колонки 0,5 М глицин-НС1-буфером.
Для работы с колонкой очень удобно использовать коллектор фракций, и, опираясь на свой опыт, мы можем рекомендовать коллектор типа Е-6000С (Ismatec, Швейцария), который предназначен для эппендорфовских пробирок. Весьма полезен, также УФ-денситометр с проточной кюветой. Небольшую пробу из каждой фракции можно проанализировать в жидкостном' сцинтилляционном счетчике радиоактивности (10 или 20 мкл пробы+10 мл сцинтиллятора Picofluor, Packard)'. После измерения радиоактивности в каждой фракции определяют оптическую плотность при 280 нм. Фракции, соответствующие белковым пикам (обычно около фронта первой элюции кислым буфером),, хранят при 4°С после добавления 10 мкл 10%-ного NaN3 ft 25 мкл 20%-ного БСА (для предотвращения адсорбции меченых иммуноглобулинов на стенках пробирки). Типичный профиль элюции для описанной колонки приведен на. рис.. 12-1.
-224 Глава 12
Б. Очистка с помощью преципитации
1. Буферные растворы
Используют следующие растворы:
ЗФР — забуференный фосфатами солевой раствор, НСА — «асыщенный раствор сульфата аммония, буфер с низкой ионной силой: 5 мМ фосфат натрия, pH 5,8 (готовят 10-кратный исходный раствор и разводят его по мере необходимости).
2. Методика осаждения
Как отмечено выше, сульфат аммония можно добавлять непосредственно к культуральной жидкости до достижения 50%-ного насыщения (29,1 г на 100 мл). Раствор выдерживают на холоду 1—2 дня до тех пор, пока не сформируется видимый осадок. Преципитированный материал осаждают центрифугированием (30 мин при 2000 g при 10 °С) и растворяют в 1/10 исходного объема ЗФР. Затем к полученному раствору добавляют равный объем НСА и минимум в течение ночи выдерживают смесь на холоду для формирования осадка. Еще раз повторяют всю процедуру переосаждения. Полученный в результате «финальный» осадок растворяют в 1 мл ЗФР и диализуют сначала против ЗФР, а потом в течение ночи против трех смен буфера с низкой ионной силой. Диализ удобно проводить в простом устройстве, которое описали Полит и соавторы (Pohlit -et al., 1979). Это устройство дает возможность проводить одновременный диализ многих образцов и легко получать после диализа радиоактивный материал.
Образовавшийся в буфере с низкой ионной силой преципитат осаждают центрифугированием, но супернатант, который иногда содержит большую часть антител, не выливают, а сохраняют. К осадку добавляют 1 мл ЗФР и ту часть его, которая переходит в раствор, используют как очищенный препарат антител; нерастворившуюся часть осадка отбрасывают. Очищенный препарат антител и супернатант в буфере с низкой ионной •силой хранят при 4°С после добавления азида натрия и БСА, как описано выше.
