Иммунологические методы исследований - Лефковитса И.
ISBN 5-03-0011-70-6
Скачать (прямая ссылка):
(За2-Молекулы были выявлены в материале, эквивалентном 106 клеток, меченных 10 мин с радиофлюорографическим детектированием при экспозиции в течение 1 нед. Мы считаем, что в ситуации, когда можно применять длительное мечение и на гели можно наносить большие количества материала, возможно выявление 100 молекул белка на клетку.
214 Глава 11
2. Минимально допустимое
для анализа число клеток в клоне
При получении клонов (Т-клеток) из одиночной клетки-предшественника часто имеют дело с 103—10* клетками в клоне. Если включение метки происходит в течение ночи в присутствии 358-метионина (50 мкКи/мл) в среде без немеченого метионина, а затем проводят лизис, двумерный электрофорез и радиофлюорографию гелей, то, как правило, получают хорошее белковое картирование. Наименьший клон, который удалось успешно проанализировать в нашей лаборатории (Kettman, Lefkovits, 1984 а, b), насчитывал 300 клеток. Время экспозиции при радиофлюорографии составляло 1 мес.
Наши попытки пометить клоны В-клеток были неудачными.
Б. Окрашивание серебром
или биосинтетическое мечение?
Мы получали удовлетворительные результаты при окрашивании гелей серебром, однако там, где это возможно, мы предпочитаем применять биосинтетическое мечение. Относительно небольшие изменения количества образцов, наносимых на гель для двумерного разделения, могут быть причиной получения столь различных картин фракционирования, что их трудно сравнивать. В случае радиоавтографии (или флюорографии) разницу в картинах распределения пятен в двух гелях, различающихся на порядок по количеству нанесенного материала, можно компенсировать подбором соответствующего времени экспозиции.
В. Проблема амфолинов
Системы двумерного электрофореза (или по крайней мере модификация ISODALT) представляются в настоящее время вполне стандартизованными. И тем не менее получение хорошей смеси амфолинов остается вопросом удачи. Мы работаем с одной и той же смесью амфолинов с 1983 г. и получаем в основном удовлетворительные результаты (рис. 11-13). Для некоторых образцов, по-видимому, может не хватать буферной емкости солюбилизирующего буфера, и в результате может происходить наложение пятен в отдельных участках гелей или сдвиг всей картины разделения к кислому или щелочному концу геля.
Г. Электроэндосмос
При слишком длительном изоэлектрофокусировании наблюдается неудовлетворительное разделение белков на щелочном конце геля. Причиной этого является нестабильность градиента
Использование системы ISODALT
215
Рис. 11-13. Радиоавтограф белков после двумерного разделения. В-клетки активировали в течение 24 ч ЛПС н затем метили в течение ночи 358-метионином (50 мкКи/мл). Нанесен материал, эквивалентный 105 клеткам. Экспозиция геля 5 дней.
pH на данном участке, в результате чего уже сфокусированные белки вновь вынуждены мигрировать, так как изменяется pi среды. Эта повторная миграция приводит к ращеплению полос на щелочном конце геля. Для устранения подобного недостатка следует сократить время разделения или провести неравновесное разделение. Тип разделения, называемый неравновесным электрофорезом в градиенте pH (НЭГрН), в данной главе не рассматривается (Sidman, 1981).
Д. Горизонтальное искажение полос
Белки, присутствующие в разделяемом материале в больших количествах, хорошо фракционируются в первом направлении, но начинают выходить из столбика геля при переносе в уравно-
216 Глава 11
вешивающий буфер. Диффузия белка из геля продолжается при разделении во втором направлении, из-за чего белок может «расползаться» вдоль столбика, а затем перемещаться во втором направлении в виде горизонтальной полосы. Этого можно избежать, промывая столбик геля перед его нанесением на пластину для разделения во втором направлении. Правда, этот прием эффективен не всегда.
Е. Сопоставление радиоавтографии и радиофлюорографии
При радиоавтографии гелей получают пятна меньших размеров, чем при радиофлюорографии, т. е. два пятна, расположенные очень близко друг к другу, легче различить при использовании радиоавтографического метода. Радиофлюорографию применяют в тех случаях, когда приходится иметь дело с малыми количествами материала или когда сомневаются в успехе использования радиоавтографии.
Литература
Anderson N. G., Anderson N. L. (1978). Anal. Biochem., 85, 331.
Kettman J., Lefkovits I. (1984a). Eur. J. Immunol., 14, 769—777.
Kettman J., Lefkovits I. (1984b). Eur. J. Immunol., 14, 778—781.
O'Farr el P. H. (1975). J. Biol. Chem., 280, 4007.
Sidman Ch. (1981). In: Immunological Methods (I. Lefkovits and B. Pernis, eds.), Vol. 11, p. 57. Academic Press, New York.
Глава 12
Типирование тканей с использованием биосинтетически меченных моноклональных антител
К. Ф. Линдал
I. ВВЕДЕНИЕ
А. Принцип метода
Описанный в этой главе метод основывается на том, что клетки гибридом способны включать радиоактивную экзогенную метку в синтезируемые ими белки. Очищенные антитела стабильны и специфически связываются с любой клеткой-мишенью, живой или убитой, если эта клетка несет антигены, узнаваемые данными антителами. Тест связывания антител надежен, достаточно гибок и хорошо воспроизводим. Он позволяет получать ¦количественные данные, причем результаты регистрируются автоматически. Примеры использования этого метода, приведенные в данной главе, полностью относятся к исследованиям аллоантигенов мышей, однако подобный подход применим ко всем типам клеток, для которых имеются соответствующие моноклональные антитела.
