Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Лефковитса И. -> "Иммунологические методы исследований" -> 78

Иммунологические методы исследований - Лефковитса И.

Лефковитса И., Перниса Б. Иммунологические методы исследований — М.: Мир, 1988. — 530 c.
ISBN 5-03-0011-70-6
Скачать (прямая ссылка): immunologicheskiemetodi1988.djvu
Предыдущая << 1 .. 72 73 74 75 76 77 < 78 > 79 80 81 82 83 84 .. 239 >> Следующая

5. Извлечение 1SO -гелей из трубок
Источник тока отключают, выливают буфер из верхней электродной камеры и стойку с трубками помещают в штатив для извлечения гелей (рис. 11-11). Одноразовый шприц на 5 мл наполняют водой и к нему подсоединяют обрезанный желтый наконечник для эппендорфовских пипеток, после чего давлением воды гели выталкивают из трубок в пронумерованные флаконы, в которые предварительно внесен уравновешивающий буфер (разд. II, Б, 6). Флаконы закрывают, инкубируют в них гели, несколько раз встряхивая и через 15—30 мин помещают в холодильную камеру при температуре —70 °С, где они хранятся до последующего разделения во втором направлении. Стойку с трубками для ISO-гелей промывают водой и помещают в тефлоновый отмывочный сосуд с хромовой кислотой.
Г. Разделение по размеру: DALT-разделение
1. Мытье кассет для геля
Использованные кассеты промывают дистиллированной водой. Детергенты не используют, так как в ходе разделения кассеты находились в буфере, содержащем детергент (ДСН). Остатки полиакриламида удаляют вручную, после чего все 20 кассет моют в полуоткрытом виде на моечной машине (Miele) со специальной программой обработки. Влажные кассеты вынимают из контейнера моечной машины и помещают в сушильный шкаф, через который продувается воздух. Пластины складывают и хранят или непосредственно в сосуде для заливки, или в шкафу, завернув их в пленку Saran.
Использование системы ISODALT
20&
2. Подготовка системы для создания градиента
Устанавливают аппарат для создания градиента и соединительные трубки перекрывают, как показано на рис. 11-12. В сосуд для заливки кассет помещают 22 кассеты и наклоняют его-под углом ~45° (разд. II, А, 7). Голубой вытесняющий раствор (50%-ный глицерол, подкрашенный бромфеноловым синим), впускают до тройника. Перекрывают вакуумную линию и включают магнитную мешалку. Серийные номера гелей (напечатанные на машинке на фильтровальной бумаге) отрезают и помещают перед сосудом для заливки.
3. Заливка DALT-гелей
Два сосуда для лиофили-зации — один для «легкого», а второй для «тяжелого» компонентов градиента — помечают соответствующим образом.
В «легкий» сосуд наливают 380 мл буфера для «легкого» раствора и 190 мл исходной акрил амидной смеси. В «тяжелый» сосуд вносят 210 мл буфера для «тяжелого» раствора и 420 мл исходной акриламидной смеси. Содержимое обоих сосудов подвергают дегазации. После этого в «легкий» сосуд добавля- Рис. 11-11. Выход ISO-гелей из тру-ют 5,8 мл ДСН (разд. II, Б, бок под давлением, воды.
12) и 6,5 мл персульфата аммония (разд. II, Б, 5) и содержимое сосудов перемешивают. В «тяжелый» сосуд добавляют 6 мл ДСН (разд. II, Б, 12) и
3 мл персульфата аммония (разд. II, Б, 5) и также перемешивают его содержимое.
Затем в «легкий» сосуд вносят 60 мкл ТЕМЭД и заливают его содержимое в правую камеру аппарата для создания градиента. Аппарат наклоняют, чтобы раствор мог попасть в систему трубок. При этом стараются, чтобы пузырьки воздуха поднимались и выходили из трубок. В «тяжелый» сосуд добавляют 10 мкл ТЕМЭД и выливают его содержимое в левую камеру аппарата для создания градиента. При. этом большого числа
14—1278
-210 Глава 11
воздушных пузырьков не образуется, так как соединительные трубки перекрыты и заполнены «легким» раствором.
Теперь убирают зажимы, помеченные 1 и 2 на рис. 11-12, и смесь впускают в сосуд для заливки гелей. Проверяют скорость перемешивания на магнитной мешалке и, если это необходимо, корректируют ее. Уровень акриламидной смеси в наклонном сосуде для заливки поднимается и сосуд переводят в вертикальное положение. После этого линию подачи акрила-
Рис. 11-12. Система для заливки градиентных гелей в сборе. 1 и 2 — зажимы иа соединительных трубках, которые ведут к прибору, создающему градиент; 3 — зажим на трубке, отходящей от емкости с голубым вытесняющим раствором; 4 — зажим на линии водоструйного насоса.
мидной смеси перекрывают зажимом 2, открывают зажим 3 и впускают голубой вытесняющий раствор. Уровень голубого раствора должен достичь дна стеклянных кассет, но ни в коем случае этот раствор не должен попасть внутрь кассет. Затем включают водоструйный насос и открывают зажим 4. В обе камеры градиент-смесителя заливают воду, для того чтобы предотвратить полимеризацию акриламида в самом аппарате и соединительных трубках.
С правой стороны в каждую кассету вводят бумажные метки, так чтобы они опустились на дно. На гель осторожно наслаивают раствор Photoflo (примерно 1 мл раствора на каждый гель).
Трубка, соединяющая резервуар с голубым вытесняющим раствором с камерой, в которой находятся кассеты, в процессе полимеризации должна быть открыта, чтобы в аппарат могло войти больше вытесняющего раствора. При этом важно, чтобы резервуар с вытесняющим раствором находился в правильном положении. Полимеризация распространяется с верхней части
Использование системы ISODALT
211:
геля вниз, благодаря чему в геле не образуются «завихрения» или полосы. Через 1 ч после завершения полимеризации аппарат разбирают. Кассеты с гелем промывают теплой деионизованной водой и ставят в наклонном положении, чтобы с их поверхности стекла вода. Кассеты с гелями, имеющими дефекты, например содержащими пузырьки воздуха, не используют.
Предыдущая << 1 .. 72 73 74 75 76 77 < 78 > 79 80 81 82 83 84 .. 239 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed