Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Лефковитса И. -> "Иммунологические методы исследований" -> 77

Иммунологические методы исследований - Лефковитса И.

Лефковитса И., Перниса Б. Иммунологические методы исследований — М.: Мир, 1988. — 530 c.
ISBN 5-03-0011-70-6
Скачать (прямая ссылка): immunologicheskiemetodi1988.djvu
Предыдущая << 1 .. 71 72 73 74 75 76 < 77 > 78 79 80 81 82 83 .. 239 >> Следующая

205
S. Мечение in vivo
Мышам вводят в хвостовую вену 1 мКи 355-метионина и через 4 ч после этого их обескровливают и забивают. Из органов, представляющих интерес для исследователей, готовят клеточные суспензии. Из крови получают сыворотку. Дополнительного ме-чения in vitro мы не применяли.
Б. Приготовление образцов
1. Клетки
Клеточные суспензии (в объемах 0,1—0,25 мл) вносят в •центрифужные пробирки (Sarstedt, номер по каталогу 72.702) и центрифугируют в течение 30 с в центрифуге «Microfuge В» (Beckman). Надосадочную жидкость удаляют и в пробирки добавляют с помощью гамильтоновского шприца по 60 мкл солюбилизирующего буфера (разд. II, Б, 1), для того чтобы растворить клеточный осадок. Следует использовать гамильто-новский шприц (объемом 100 мкл) с иглой цилиндрической, а не конической формы. После солюбилизации повторяют 30-секундное центрифугирование, для того чтобы осадить клеточный или тканевой дебрис. Пробы выдерживают в ледяной бане, после чего пробирки запечатывают парафильмом и хранят в замороженном виде до использования.
2. Пробы сыворотки или культуральных жидкостей
Сыворотку (5 мкл) или супернатант культуральной жидкости (10—30 мкл) смешивают с солюбилизирующим буфером, так чтобы общий объем проб составил 60 мкл. Образцы хранят в замороженном виде до использования.
В. Разделение ло заряду: ISO-разделение
1. Подготовка оборудования для ISO -разделения
Стойку с трубками для ISO-гелей вынимают из тефлонового моечного сосуда с хромовой кислотой (разд. II, А, 2) и тщательно промывают деионизованной водой. Трубки высушивают по одной потоком воздуха. Затем на свое место вставляют заливочную ванночку с металлическим держателем геля и наполняют большой сосуд дистиллированной водой (1,8 л) (рис. 11-9).
206 Глава 11
2. Получение ISO-гелей
В сосуд для лиофилизации на 150 мл вносят:
8,25 г мочевины (Schwartz-Mann)
2 мл исходного раствора акриламида (разд. II, Б, 3)
6 мл воды
0,75 мл смеси амфолинов (разд. II, Б, 4)
А Б В
Рис. 11-9. Схематическое изображение процесса получения ISO-гелей. А. В ванночку для заполнения трубок залита акриламидная смесь. Б. Стойка погружена в наполненный водой большой сосуд. В. Акриламидная смесь вытесняется из ваниочки и заполняет все 20' трубок.
Сосуд погружают в теплую воду (эндотермический процесс)
и, после того как растворятся все компоненты, его содержимое подвергают дегазации в течение нескольких минут на аппарате для лиофильной сушки. Если при дегазировании мочевина начнет кристаллизоваться, то содержимое сосуда повторно нагревают. После этого в сосуд добавляют:
300 мкл NP-40 (BDH, Цюрих, Швейцария)
50 мкл персульфата аммония (разд. II, Б, 5)
5 мкл ТЕМЭД (разд. II, Б, 13)
Смесь набирают в пипетку объемом 10 мл и медленно выпускают в ванночку для наполнения трубок. На содержимое ванночки осторожно наслаивают воду, так чтобы поверхность
Ирпользоваиие системы ISODA.LT
207
воды достигла верхней кромки бортов ванночки. После этого стойку с трубками и ванночкой медленно погружают в большой сосуд, наполненный водой. За счет гидростатического давления акриламидная смесь вытесняется из ванночки и заполняет все 20 трубок (рис. 11-9, Б и В) за 15—20 с. После этого гелям дают полимеризоваться в течение 1 ч.
По окончании полимеризации стойку вынимают из сосуда с водой и ванночку осторожно снимают, так чтобы осталась на месте металлическая скобка, предназначенная для удерживания полимеризованного геля. Затем с помощью бритвы отделяют
Рис. 11-10. Схема образования градиента pH в ходе префокусирования. А. Перед префокусированием. Б. Через несколько минут после начала префокусиро-вання. В. В конце префокусирования.
эту скобку от геля и удаляют остатки полимеризованного геля. Концы трубок промывают дистиллированной водой.
Из большого сосуда выливают воду, а в него наливают 2 л кислого электролита (разд. II, Б, 2). В верхнюю электродную камеру наливают 200 мл щелочного электролита (разд. II,Б,2). Для приготовления щелочного электролита следует использовать воду, подвергнутую дегазации. Пузырьки воздуха между верхним концом геля и дном верхней камеры удаляют гамильто-новским шприцем, наполненным щелочным электролитом, стараясь при этом не повредить гель.
3. Префокусирование
Аппарат со вставленной, как описано выше, стойкой с гелями подсоединяют к источнику тока при постоянном напряжении 200 В на 1 ч. В течение этого времени устанавливается градиент pH (рис. 11-10). Если этот этап опустить, то не исключено выпадение в осадок белка в верхней части геля. Последующее медленное растворение выпавшего в осадок белка в ходе изоэлектрофокусирования может привести к искривлению полос.
208 Глава 11
4. Изоэлектрофокусирование
В каждую трубку с помощью гамильтоновского шприца вносят пробы объемом 5—40 мкл. При нанесении проб не следует взмучивать слой мочевины, который образуется на гелях в процессе полимеризации. Наличие этого слоя облегчает вход пробы в гель. После нанесения проб аппарат подключают к источнику питания и устанавливают требуемое напряжение. Для нормального разделения достаточно 14 000 В-ч, что достигается при соблюдении оптимального режима 800 В в течение 17,5 ч. При больших значениях вольт-часов на щелочном конце гелей из-за электроэндосмоса может происходить искривление полос. Этот эффект будет более подробно обсуждаться в разд. IV.
Предыдущая << 1 .. 71 72 73 74 75 76 < 77 > 78 79 80 81 82 83 .. 239 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed