Иммунологические методы исследований - Лефковитса И.
ISBN 5-03-0011-70-6
Скачать (прямая ссылка):
Литература
Correa-Freire М., Powers G., Engelhard V. (1984). J. Immunol., 132, 69—75. Engelhard V., Strominger J. L., Mescher М., Burakoff S. (1978). Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 75, 5688—5691.
Fast L. D., FanD. P. (1978). J. Immunol., 120, 1092—1098.
Hale A. H., Ruebush M. J., Lyles D. S., Harris D. T. (1980). Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 77, 6105—6108.
Hay man М., Crumpton M. (1972). Biochem. Biophys. Res. Commun., 47, 923— 930.
Helenius A., Simons K. (1975). Biochim. Biophys. Acta, 415, 29—79.
Helenius A., Fries E., Kartenbeck J. (1977). J. Cell Biol., 75, 866—880.
Holloway P. W. (1973). Anal. Biochem., 53, 304—408.
Leserman L. D., Machy P., Barbet J. (1981). Nature (London), 293, 226—228.
McKnight S. G. (1977). Anal. Biochem., 78, 86—93.
Takacs B„ Staehelin T. (1981). In Immunological Methods (I. Lefkovits, B. Per-nis, eds.), v. II, Academic Press, New York. [Имеется русский перевод в книге «Иммунология; методы исследований», М. «Мир», 1983.]
Vainstein A., Rasin A., Graessman A., Loyter А. (1983). In: Methods in Enzy-mology (R. Wu, L. Grossman, and K. Moldave, eds.), Vol. 101, pp. 492—512. Academic Press, New York.
Глава 9
Обнаружение гликолипидных антигенов с помощью моноклональных антител
М. Брокхаус
I. ВВЕДЕНИЕ
За последние несколько лет с помощью моноклональных антител было выявлено большое число новых антигенных детерминант клеточных поверхностей. Биохимический анализ некоторых из этих антигенов затруднен из-за того, что соответствующие моноклональные антитела не преципитируют антигены из лизатов клеток. Это может быть обусловлено или слишком низким сродством антител к солюбилизированным белкам клеточных поверхностей, или тем, что антитела не устойчивы к действию детергентов, обычно используемых для приготовления лизатов клеток. Другой причиной неудач при попытках охарактеризовать антиген методами белковой химии может быть липидная природа узнаваемой антителом детерминанты клеточной поверхности. Недавно были описаны гликолипидные антигены, узнаваемые моноклональными антителами мыши, в злокачественной меланоме человека (Pukel et al., 1982), в гастроинтестинальной аденокарциноме (Magnani et al., 1982; Fukushi et al., 1984) и в линии миелоцитов человека (Huang et al., 1983). В случае гликолипидных антигенов детерминанте обычно соответствует три-или тетрасахарид на нередуцирующем конце углеводной цепи. Эти эпитопы не обязательно содержатся только в гликолипидах: они встречаются также в углеводных частях гликопротеинов. Где обнаруживаются антигены — в липидных экстрактах или в белковых фракциях — зависит от исследуемой ткани.
В последнее время к обычным методам анализа липидных антигенов, таким как пассивная гемагглютинация или торможение гемагглютинации, добавились методики, основанные на опосредованном комплементом лизисе липосом, содержащих антиген (Zemmour et al., 1984), и процедуры определения антител, связанных с иммобилизованным на твердой фазе липидным антигеном (Brockhaus et al., 1981; Kannagi et al., 1983). В этой главе мы рассмотрим только процедуры последнего типа.
Часто уже по результатам предварительных тестов исследователь может определить, содержится ли данный антиген в ли-
160 Глава 9
пидной фазе, или же он является белком, причем такие выводы можно сделать, если даже антитела не преципитируют антиген. Подробное изучение липидных антигенов требует прежде всего приготовления экстракта из клеток или тканей. Некоторую информацию о химической природе исследуемого антигена может дать уже обработка этого экстракта ферментами или химическими агентами. Данные о размере антигена, а иногда и о его ¦ структуре получают, применяя тонкослойную хроматографию (ТСХ) липидного экстракта с последующей радиоавтографией связавшихся с липидами моноклональных антител. Этот метод ¦будет рассмотрен в последнем разделе главы.
II. ПРЕДВАРИТЕЛЬНЫЕ ТЕСТЫ
Белки и липиды различаются по многим физическим и биохимическим свойствам, что дает возможность простыми методами определить принадлежность изучаемого антигена к тому или иному классу соединений. Белковые антигены быстро разрушаются при мягкой обработке проназой, в то время как липидные антигены не подвержены действию протеолитических ферментов. В отличие от большинства белковых антигенов антигены липидной природы устойчивы к фиксации формальдегидом с последующим нагреванием до 80 °С. Эту процедуру можно проводить как с суспензиями отдельных клеток, так и со срезами тканей. Экстракция нативных или фиксированных формальдегидом клеток кипящим метанолом в течение 1 мин приводит к растворению части клеточных липидов, и метанольный экстракт в ряде случаев можно использовать без дальнейшей очистки для твердофазного радиоиммунологического анализа (РИА). Использование РИА описано в разд. IV.
Потеря антигенной активности клетками или срезами тканей после инкубации с нейраминидазой указывает на гликопро-теиновую или гликолипидную природу антигена и свидетельствует о том, что антигенная детерминанта содержит сиаловую кислоту. Для предварительной характеристики антигенов целых клеток могут применяться и другие гликозидазы при условии, что ферменты обладают достаточной специфичностью и свободны от протеолитической активности.
