Иммунологические методы исследований - Лефковитса И.
ISBN 5-03-0011-70-6
Скачать (прямая ссылка):
2. Моноклональные антитела к белку Н-2КЬ, продуцируемые гибридомой ,9.178, иммобилизованные на сефарозе 4В. Антитела были получены от д-ра Г. Хаммерлинга (Центр раковых исследований ФРГ, Гейдельберг)
3. ТСР-ТХ: буфер TCP, содержащий 0,1% тритона Х-100
4. 10%-ный раствор тритона Х-100
5. ТСР-ТХ, содержащий 1 М NaCl
Аффинный носитель готовят связыванием очищенных антител 9.178 с сефарозой 4В, активированной CNBr, как описано в инструкции (Pharmacia Fine Chemicals). Для очистки белка Н-2КЬ из 15 селезенок мышей достаточно 2 мл геля, содержащего около 20 мг антител.
Препарат мембран (разд. II, Б) разводят в 1 мл буфера TCP и добавляют 1 мл 10%-ного тритона Х-100. После инкубации в течение 15 мин раствор осветляют в настольной центрифуге (Eppendorf) центрифугированием в течение 10 мин при 4°С. Колонку с иммобилизованными на сефарозе моноклональными антителами 9.178 уравновешивают ТСР-ТХ, а затем в колонку вносят солюбилизированные мембранные белки при скорости потока 0,2 мл/мин. После этого колонку промывают десятью объемами ТСР-ТХ до тех пор, пока элюат не будет содержать радиоактивной метки. Н-2Кь-антиген элюируют с колонки, используя ТСР-ТХ с 1 М NaCl. Фракции, обладающие наибольшей радиоактивностью, объединяют и диализуют в течение ночи против ТСР-ТХ. С колонки элюируется около 70 % связанной с ней радиоактивности.
154 Глава 8
III. ПОЛУЧЕНИЕ ЛИПОСОМ
А. Принцип метода
Удаление детергента из растворов мембранных белков вызывает их агрегацию, обусловленную взаимодействием гидрофобных участков полипептидных цепей. Если при удалении детергента ввести липиды, то образуются бислойные пузырьки,, и мембранные белки имеют тенденцию включаться в них в липидную фазу.
Для приготовления бислойных пузырьков (липосом) можно-применять как клеточные, так и синтетические липиды. Клеточные липиды представляют собой сложную смесь фосфолипидов, гликолипидов и других компонентов. Из-за высокого содержания ненасыщенных компонентов клеточные липиды характеризуются определенной нестабильностью. С синтетическими липидами работать легче, и их состав можно подбирать в соответствии с требованиями предстоящего исследования.
Детергенты из смесей белков и липидов можно удалять диализом (Helenius et al., 1977) или адсорбцией на гидрофобных полимерах (Holloway, 1973). Адсорбция более удобна и осуществляется очень быстро, но при ее проведении могут адсорбироваться некоторые белки. Диализ — более эффективная процедура, но тритон Х-100, который является хорошим солюбилизирующим агентом для мембран, удаляется при диализе очень медленно из-за большого эффективного размера мицелл (Helenius, Simons, 1975). Поэтому целесообразно на какой-ли-бо стадии заменить тритон Х-100 легко диализуемым детергентом, например октилглюкозидом. В этой главе описываются оба метода удаления детергента.
Б. Получение клеточных липидов
Реагенты
1. Хлороформ (ч. д. a., analytical grade)
2. Метанол (ч. д. a., analytical grade)
3. Источник осушенного азота.
Предлагаемую процедуру экстракции липидов лучше всего проводить в темной комнате, для того чтобы избежать фотохимических реакций. Из одной селезенки мыши получают клетки и отмывают их дважды в TCP, используя пробирку из стекла (пирекс) с навинчивающейся крышкой. Буфер TCP удаляют как можно тщательнее и ресуспендируют клетки в 1 мл метанола. Медленно добавляют 1 мл хлороформа, перемешивают и инкубируют в течение 10 мин. Пробирку закрывают крышкой, чтобы избежать испарения растворителей и центрифугируют
Получение липосом
155
20 мин при 4000 об/мин для удаления клеточного дебриса. Супернатант переносят в чистую пробирку и осадок повторно экстрагируют 2 мл смеси хлороформ/метанол (1:1). Пробирку центрифугируют еще раз и супернатант объединяют с супернатантом первого центрифугирования. Осветленный раствор липидов фильтруют через стеклянный фильтр и высушивают в стеклянной пробирке под потоком сухого азота. Для больших объемов можно использовать роторный испаритель. Повторно растворяют пленку высушенного липида в 0,5 мл смеси хлороформ/метанол и удаляют нерастворившийся материал центрифугированием. Прозрачный раствор липидов переносят в чистую пробирку и еще раз удаляют растворитель потоком осушенного азота. Из одной селезенки мыши удается получить 1—2 мг липидов.
В. Синтетические липидные смеси
Высококачественные очищенные липиды производятся многими фирмами — поставщиками реактивов, такими как, например, Sigma. Они, как правило, поставляются или в виде растворов в смеси хлороформ/метанол, или в порошкообразном виде. Вполне приемлемой исходной смесью для экспериментов по реассоциации является смесь 50% фосфатидилхолина (лецитин из яиц) и 50% холестерола. Физические свойства липосом могут изменяться при добавлении других компонентов, таких как фосфатидилсерин, стеариламин или кардиолипин. Липиды смешивают в чистой стеклянной пробирке и, если это необходимо, растворители удаляют потоком осушенного азота. К липидам в качестве детергента добавляют или тритон Х-100, или октилглюкозид (Calbiochem) в десятикратном или пятикратном избытке соответственно, а затем в достаточном для растворения липидов и детергента количестве ацетон. Растворитель удаляют потоком осушенного азота, после чего на поверхности стекла остается тонкая липидно-детергентная пленка.
