Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Лефковитса И. -> "Иммунологические методы исследований" -> 57

Иммунологические методы исследований - Лефковитса И.

Лефковитса И., Перниса Б. Иммунологические методы исследований — М.: Мир, 1988. — 530 c.
ISBN 5-03-0011-70-6
Скачать (прямая ссылка): immunologicheskiemetodi1988.djvu
Предыдущая << 1 .. 51 52 53 54 55 56 < 57 > 58 59 60 61 62 63 .. 239 >> Следующая

Б. Приготовление препаратов клеточных мембран
Реагенты. Забуференный трисом солевой раствор (TCP): 10 мМ трис-НС1, pH 7,5, 130 мМ NaCl. Лизирующий буферный раствор: 10 мМ трис-НС1, pH 8,0, содержащий 3 мМ MgCl2,
1 мМ фенилметилсульфонилфторид (ФМСФ) (Sigma) и 100 ед./мл апротинина (Sigma).
Около 109 лимфоидных клеток (из 15 селезенок) промывают .в изотоническом TCP и осаждают в 50-миллшштровой пластмассовой центрифужной пробирке. Для контроля промежуточ-лых этапов выделения целесообразно пометить небольшое число клеток 355-метионином (инкубация в течение ночи) и добавить меченые клетки к основному клеточному пулу. Затем с помощью пастеровской пипетки клетки ресуспендируют в 1 мл •охлажденного до нулевой температуры лизирующего буфера, добавляют еще 9 мл этого охлажденного буфера и клеточную суспензию инкубируют в ледяной бане в течение 30 мин. Затем клеточную суспензию гомогенизируют при нулевой температуре 10—20 движениями пестика в гомогенизаторе Даунса (стекло — стекло). На этом этапе при рассматривании препарата в микроскоп интактными должны оставаться только ядра клеток. Если присутствует более 10% интактных клеток, то следует дополнительно гомогенизировать клеточную суспензию 10 движениями пестика.
Гомогенат снова помещают в центрифужную пробирку и центрифугируют в центрифуге с охлаждением при 2000 об/мин для удаления ядер. Мутный супернатант собирают и добавляют к нему сухую сахарозу до конечной концентрации 40°/о (вес/ /объем). После этого суспензию помещают в пробирку для ультрацентрифуги на 37 мл [пробирки для ротора SW 28 (Beckman) или для аналогичного ротора].
Поверх суспензии мембран в 40%-ной сахарозе наслаивают до заполнения пробирки 30%-ный раствор сахарозы на лизиру-ющем буфере. Пробирку центрифугируют при 25 000 об/мин в течение 3 ч в роторе SW 28 (Beckman). Затем ее осторожно вынимают и собирают опалесцирующий слой мембран, находящийся между двух сахарозных слоев, используя шприц или пастеровскую пипетку. В таком виде мембраны можно хранить на холоду в течение одного — двух дней. Однако в большинстве случаев суспензию разводят в 10 раз лизирующим буфером и
152 Глава 8
подвергают повторному центрифугированию в течение 3 ч при 25 ООО об/мин для получения осадка мембран. Эта процедура дает практически чистый (~95%-ный) препарат мембран. Хранить препараты мембран не рекомендуется, лучше всего получать их непосредственно перед использованием. Если это необходимо, мембраны можно хранить в темноте при —80 °С в атмосфере азота. Из одной селезенки можно получить около 1,5 мг (сырой вес) мембран лимфоидных клеток.
В. Выделение мембранных гликопротеинов
Большинство мембранных белков содержит боковые углеводные цепи с маннозными остатками. Многие из этих белков связываются со специфическим по отношению к маннозе лекти-ном из Lens culinaris (LcH, или ГЧ). Адсорбцию и элюцию гликопротеинов лимфоцитов свиньи с аффинного носителя LcH-сефарозы впервые описали Хейман и Крамптон (Hayman, Crumpton, 1972).
Реагенты
1. 2ХЬсН-буфер: 100 мМ трис-НС1, pH 8,0, содержащий
0,2% (по объему) тритона Х-100, 1 мМ СаСЬ и 1 мМ
MgCl2
2. 10%-ный водный раствор тритона Х-100
3. 5 мл ЬсН-сефарозы (Pharmacia Fine Chemicals)
4. 2%-ный (вес/объем) раствор а-метилманнозида в LcH-буфере
ЬсН-сефарозу помещают в маленькую стеклянную колонку (объем 5—10 мл) и хорошо промывают LcH-буфером. Осадок мембран (разд. II, Б) ресуспендируют в 1 мл 2ХЕсН-буфера, после чего добавляют 1 мл 10%-ного тритона Х-100.
Последующие процедуры лучше всего проводить в холодной комнате. Нерастворимый материал осаждают с помощью настольной центрифуги. Раствор вносят в колонку с LcH-еефаро-зой. Скорость потока должна составлять 0,5 мл/мин. После нанесения образца колонку промывают десятикратным объемом (примерно 50 мл) LcH-буфера. Если в пробе присутствуют белки, меченные 35S, то элюцию материала с колонки можно контролировать на сцинтилляционном счетчике. После промывания колонки с нее снимают адсорбированные гликопротеины с помощью 2%-ного а-метилманнозида и фракции с максимальной активностью объединяют. Полученный материал диализуют 3 ч против буфера для реассоциации (состав буфера см. в разд Ш, Г).
Получение липосом
153
Г. Очистка индивидуальных белков с помощью аффинной хроматографии
Наличие моноклональных антител против отдельных мембранных белков часто дает возможность быстро в один этап выделить эти белки из суммарных экстрактов мембран и очистить их. Важно, чтобы сродство взаимодействия антител с соответствующим антигеном было достаточно большим, чтобы удержать антиген на иммуноносителе в ходе отмывки колонки. Вместе с тем необходимо, чтобы антиген снимался с колонки в достаточно мягких условиях.
Для очистки белка Н-2КЬ, описанной ниже, используются моноклональные антитела, которые связывают антиген при физиологических ионных силах, но не реагируют с ним при высоких концентрациях солей.
Реагенты
1. Мембраны лимфоцитов линии мышей C57BL/6 или опухолевых клеток линии EL4 (Н-2Ь), предпочтительно меченные 358-метионином
Предыдущая << 1 .. 51 52 53 54 55 56 < 57 > 58 59 60 61 62 63 .. 239 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed