Иммунологические методы исследований - Лефковитса И.
ISBN 5-03-0011-70-6
Скачать (прямая ссылка):
На колонках для ГА-ВЖХ связываются все моноклональные IgG мыши и крысы (Henson, 1985). Профиль элюции моноклонального IgG2b из асцитной жидкости мышей приведен на рис. 7-5. Мышиные и крысиные моноклональные IgG элюируются с колонки ГА-ВЖХ при концентрациях фосфатов от 60 до 200 мМ. Очистка в одну стадию достижима для моноклональных антител, которые элюируются при высоких концентрациях фосфатного буфера. Некоторые моноклональные антитела элюируются при низких концентрациях фосфата и плохо отделяются от основной массы сывороточных белков. Предварительное осаждение глобулинов сульфатом аммония дает возможность получать с помощью ГА-ВЖХ очищенные препараты многих, но не всех типов моноклональных антител. Тем не менее из собранных иммуноглобулиновых фракций трудноочищае-мых антител после диализа и рехроматографии удается получать достаточно чистые препараты, хотя и с некоторыми потерями.
10—1278
Л46 Глава 7
Еще один вариант использования колонок ГА-ВЖХ основан на том, что с их помощью можно дифференцировать специфические моноклональные антитела по различиям в их легких цепях (Juarez-Salinas et al., 1984). Показано, что моноклональные антитела имеют различные легкие цепи, что позволило разделить антигенсвязывающие и неактивные антитела, •содержащие легкие цепи разных типов. Моноклональные
Время, мин
Рис. 7-5. Очистка с помощью ГА-ВЖХ моноклональных IgG^, из асцитной жидкости мышн, инокулированной соответствующей гибридомой. Асцитную жидкость (0,1 мл) вносили непосредственно в колонку для ГА-ВЖХ и хроматографировали, как описано в тексте для аналитического разделения: после 10-минутной изократической элюции подключали градиент фосфатного буфера (10—240 мМ). IgG2b элюнровалнсь с колонки в положении, указанном стрелкой. Анализ с помощью электрофореза в полиакриламидном геле с ДСН показал присутствие в препарате лишь примеси сывороточных белков, от которых легко избавиться при рехроматографии.
антитела, очищенные на аффинной колонке, т. е. специфически связывающиеся с антигеном, также гетерогенны по структуре цепей, что выявляется при ГА-ВЖХ (рис. 7-6). Итак, колонки ГА-ВЖХ могут применяться как для очистки, так и для анализа чистоты и гомогенности моноклональных антител.
2. ГА-ВЖХ моноклональных антител
Хроматографию проводили на системе 8800LC (du Pont), оснащенной инжектором U6K и детектором поглощения (модель 440, Waters) с самописцем W и W316 Datasyn. Для сбора фракций использовали коллектор Redirac (LKB). Образцы для аналитических разделений или предварительно диализовали против 10 мМ фосфата натрия, pH 7,0, 0,3 мМ СаС12 (буфер А),
Хроматография иммуноглобулинов
147
а затем вносили в колонку, или, как в случае асцитной жидкости, вносили непосредственно без диализа. Все образцы центрифугировали для удаления частиц при 10 ООО g в течение 5 мин. Хроматографию проводили на колонке B'ioGel НРНТ (50Х Х4,0 мм) с предварительной колонкой (Bio-Rad). Градиентная элюция для аналитических разделений включала изократиче-
Время, мин
Рис. 7-6. Хроматография мышиных моноклональных IgGi-антител, предварительно очищенных аффинной хроматографией. Моноклональные антитела А4.1 против арс (любезно предоставленные д-ром Немацее) разделяются на три пика в зависимости от содержания легких цепей. 50 мкг антител А4.1 вносили в колонку в 10 мМ фосфате натрия, pH 7,0, 0,3 мМ СаС12 и элюировали с использованием аналитического градиента: сначала проводили 10-минутную изо-кратическую элюцию, а затем элюцию линейным градиентом фосфатного буфера (10—240 мМ). Фракции, соответствующие пикам, собирали, диализовали, рехроматографировалн и анализировали с помощью электрофореза в полиакриламидном геле с ДСН. В пиках 1 и 2 выявлены два типа легких цепей, которые представлены в разных количествах, а в пике 3 — только один тип легких цепей.
скую элюцию буфером А в течение 10 мин после введения образца (10 мкг — 5 мг белка) и затем элюцию линейным градиентом фосфата натрия от 10 до 240 мМ в течение 30 мин. Скорость потока составляла 0,5 мл/мин. Для создания линейного градиента использовали буфер А и 0,3 М фосфат натрия, pH 7,0, 0,01 мМ СаС12 (буфер Б). Поскольку концентрация фосфата кальция в буферах близка к пределам растворимости, чрезвычайно важно профильтровать растворы (размер пор фильтра 0,45 мкм). Колонка очень чувствительна к избыточному давлению, поэтому необходимо следить за тем, чтобы давление не было слишком высоким, иначе может быть повреждена матрица.
10*
348 Глава 7
Препаративную хроматографическую очистку антител производили следующим образом. Образцы (0,5—2 мл асцитной жидкости) вносили в колонку, уравновешенную 50 мМ фосфатом натрия, pH 7,0. Дополнительное нанесение материала производили после того, как с колонки элюировали большую часть не-связавшегося материала. На колонку ГА-ВЖХ удавалось без перегрузки наносить до 3 мл асцитной жидкости. После внесения материала через колонку в течение 10 мин пропускали бу-¦фер для нанесения. Затем в течение 5 мин через колонку пропускали линейный градиент фосфатного буфера от 50 до 300 мМ, после чего проводили 10-минутную изократическую элюцию 300 мМ фосфатом натрия. Фракции после препаративного разделения объединяли и после диализа в буфере А проводили их рехроматографию с использованием градиента для .аналитического варианта метода.
