Иммунологические методы исследований - Лефковитса И.
ISBN 5-03-0011-70-6
Скачать (прямая ссылка):
Б. Гель-проникающая ВЖХ (ГП-ВЖХ)
Разделение тяжелых и легких цепей иммуноглобулинов — широкоизвестная процедура в иммунохимии. Оно включает восстановление и алкилирование специфических антител, диализ
Рис. 7-2. Разделение тяжелых (Н) и легких (L) цепей кроличьих антител 7995L против бензоата. Восстановленные и алкилированные антитела диализо-вали в течение ночи при 4°С против 1 М пропионовой кислоты. Препарат антител (0,6 мл, 1 мг/мл) вносили в колонку и элюировали 1 М пропионовой кислотой при скорости потока 0,8 мл/мии.
Хроматография иммуноглобулинов
141
лротив 1н. уксусной или 1н. пропионовой кислоты и элюцию легких и тяжелых цепей при гель-фильтрации в соответствующей кислоте (Fleischwan et al., 1967). Эту процедуру часто использовали при получении материала для дальнейшего биохимического анализа выделенных цепей или для исследования их рекомбинации. При фракционировании цепей гель-фильтрация на носителях для ВЖХ имеет ряд преимуществ. Во-первых, к ним относится быстрота разделения, которое продолжается менее 45 мин. Во-вторых, возможность исследовать очень небольшие количества белка, которая появилась с введением более чувствительных методов определения белков. Характерное для методов ВЖХ высокое разрешение и использование чувствительных детекторов дают возможность получать хорошие разделения с малыми количествами белков. Благодаря этому можно анализировать антитела, которые или очень дорого стоят, или очень трудно получить в больших количествах. В-третьих, при однократной хроматографии на обычной колонке трудно обеспечить полное разделение легких и тяжелых цепей некоторых антител; для получения чистых препаратов необходимо второе или даже третье фракционирование. Так бывает и при использовании ВЖХ. Препарат тяжелых цепей часто загрязнен небольшими количествами легких цепей. Однако в случае ВЖХ второе и третье разделение можно провести очень быстро. При работе с кроличьими иммуноглобулинами удавалось получить чистые препараты тяжелых и легких цепей с использованием только пропионовой кислоты (рис. 7-2). Разделить легкие и тяжелые цепи мышиных иммуноглобулинов оказалось гораздо труднее; вероятно, связи между ними достаточно прочные (рис. 7-3, А). В данном случае для полного разделения тяжелых и легких цепей требовалась элюция смесью 4,5 М гуани-динхлорида и 1 М пропионовой кислоты (рис. 7-3, Б). Дикер-
Рис. 7-3. Оптимизация фракционирования тяжелых и легких цепей мышиных иммуноглобулинов при ГП-ВЖХ. А. Хроматография в 1 М пропионовой кислоте мышиных сывороточных антител против арсоната (арс), содержащих перекрестно реагирующие идиотипы (CRI+). Восстановленные и алкилированные антитела (0,5 мл, 1 мг/мл) днализовалн в течение ночи против 1 М пропионовой кислоты, вносили в колонку и элюировали при скорости потока 1 мл/мин. Б. Хроматография мышиных антител против арс (0,05 мл, 1 мг/мл), содержащих перекрестно реагирующие идиотипы (CRI+) в 1 М пропионовой кислоте м 4,5 М солянокислом гуанидине. Можно видеть улучшение разделения цепей. Антитела проходили те же этапы обработки, что и в Л, но прн диализе и элюции к растворителям добавлили 4,5 М солянокислый гуанидин. Три пика, элюируемые перед тяжелой цепью, вероятно, соответствуют целым антителам, димерам тяжелых цепей н мономерам, содержащим одну тяжелую и одну легкую цепь (по данным электрофореза в полиакриламидном геле). Для получения чистого препарата тяжелых цепей необходимо концентрирование и рехроматография фракций.
142 Глава 7
ман и др. (Dickerman et al., 1981) разделяли тяжелые и легкие цепи мышиных иммуноглобулинов с помощью ВЖХ в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН). Разделение было очень хорошим, но ДСН трудно удалить с колонки для ГП-ВЖХ (Regnier, 1983), а также из препаратов белка.
1. Очистка легких
и тяжелых цепей иммуноглобулинов кролика
Иммуноглобулин кролика в концентрации от 1,0 до 20 мг/мл в 0,55 М трис-буфере восстанавливали и алкилировали, как описано Флейшманом и др. (Fleischman et al., 1967). Затем иммуноглобулин диализовали против 1 М пропионовой кислоты в течение ночи при 4 °С.' Для удаления преципитированного белкового материала, который может присутствовать в небольших количествах, раствор центрифугировали при высокой скорости или фильтровали. Обычно удовлетворительные результаты получали при центрифугировании в маленькой высокоскоростной центрифуге при 10 ООО g в течение 4—5 мин. Мы предпочитаем фильтрацию через фильтр (размер пор 0,45 мкм), устойчивый к соответствующему растворителю. Такие фильтры выпускаются многими фирмами. После этой стадии образец хроматографируют на тандемно соединенных колонках TSK-G 2000 SW и TSK-G 3000 SW, уравновешенных охлажденной во льду 1 М пропионовой кислотой. Обе колонки имеют размеры 75X600 мм; на них можно наносить образец в объеме до 0*6 мл. Количество наносимого суммарного белка не должно превышать 1,3 мг, чтобы в каждом пике было не более 1 мг. Номинальная максимальная нагрузка белка на колонку TSK длиной 600 мм составляет 10 мг, но если при этом на пик приходится более
1 мг белка, то разрешение ухудшается. Образец вводят с помощью инжектора U6K в петлю объемом 2 мл (Waters Associates). Элюцию осуществляют, подавая (насос М-45, Waters Associates) охлажденную до 0 °С 1 М пропионовую кислоту (Aldrich) со скоростью 1 мл/мин. Разрешение было удовлетворительным при скоростях потока от 0,5 до 1 мл/мин. Измерение белка при хроматографии осуществляли с помощью детектора поглощения (модель 440, Waters Associates) при 280 нм или с помощью Uvicord S (LKB) с проточной ячейкой для ВЖХ при 276 нм. Рехроматографию для определения чистоты полученных препаратов проводили после их концентрирования на ячейке модели 3 (Amicon) с мембраной YM-5.
