Иммунологические методы исследований - Лефковитса И.
ISBN 5-03-0011-70-6
Скачать (прямая ссылка):
Фракционирование удалось улучшить также при использовании колонок с однородными по размеру пор крупнопористыми частицами. Это особенно важно при фракционировании белков, так как при этом устраняется эффект расширения зон крупных молекул (из-за гетерогенности размеров пор) и можно использовать более низкие давления. Возможность получения носителей с порами одинаковых размеров, обладающих низкой неспецифической сорбцией, обеспечивает прочную основу для
гп-вжх.
С практической точки зрения следует отметить, что для белков большое значение N не столь принципиально, как для менее высокомолекулярных веществ (Regnier, 1983).
В. Оборудование
В настоящее время разнообразие оборудования для ВЖХ белков столь огромно, что описать его детально невозможно. В нашей лаборатории применяются две основные системы. Первую систему, оснащенную одним насосом, используют только для ГП-ВЖХ. Вторая система снабжена тремя насосами, в ней
Программируемое
^ фракций
Рис. 7-1. Блок-схема системы для ВЖХ. Компоненты системы описаны в тексте.
одновременно смешиваются и подаются четыре компонента подвижной фазы. В нее входит также программируемое устройство для создания градиента. Подробное описание оборудования и схемы организации систем для ВЖХ приведено в гл. 5 сборника, опубликованного в 1981 г. (Alvarez et al., 1981). На рис. 7-1 представлена блок-схема всех необходимых компонентов системы для ВЖХ. Ниже мы обсудим несколько важных моментов, касающихся каждого из компонентов системы.
138 Глава 7
1. Растворители
Все используемые растворители должны быть самой высокой чистоты, предпочтительно специально очищенные для ВЖХ. Для приготовления водных буферных растворов в нашей лаборатории используют воду сразу же после дистилляции и для удаления органических примесей пропускают ее через фильтр с активированным углем. Присутствующие до этой обработки следовые количества органических веществ приводили к искажениям базовой линии при градиентной элюции в ходе ОФ-ВЖХ. Для удаления микрочастиц, способных засорить колонку, все водные буферные растворы перед использованием следует пропускать через фильтр с размером пор 0,45 мкм.
2. Насосы
Насосы должны создавать контролируемый постоянный поток с минимальной пульсацией. Ранее большинство насосов для ВЖХ должно было работать в режимах с очень высоким сопротивлением и соответственно обратным давлением. В настоящее время в связи с применением для ВЖХ белков крупнопористых матриц в этом уже нет необходимости. Теперь в большинстве случаев используют давление ниже ~70 атм, а для многих процедур разделения обратное давление не превышает ~14 атм.
3. Инжектор, соединительные трубки
Чрезвычайно важно, чтобы соединительные трубки между инжектором, предколоночным фильтром, предварительной колонкой, разделительными колонками, детектором и коллектором имели минимальный объем, так как при этом сводится к минимуму расширение пиков из-за диффузии. Использование пред-колоночного фильтра между инжектором и колонкой необходимо для того, чтобы избежать повреждения матрицы частицами, попавшими в систему случайно при введении образца или появившимися в результате отделения мелких металлических частиц от трущихся частей инжектора. Инжектор высокого давления должен быть также удобным в работе. Накопленный в нашей лаборатории опыт позволяет заключить, что для разделения белков с помощью ВЖХ наиболее подходящим является инжектор с петлей на 2 мл. Инжектор позволяет вводить в петлю любой объем образца вплоть до 2 мл. При повороте клапана инжектора петля подсоединяется таким образом, что на колонку первой подается последняя введенная в петлю порция образца. Это сводит к минимуму размазывание полосы материала, что особенно важно для ГП-ВЖХ.
Хроматография иммуноглобулинов
139
4. Матрицы для колонок
Для разделения белков пригодны многие наполнители колонок, но лучше всего для этих целей использовать крупнопористые матрицы, для которых характерно низкое неспецифическое связывание белков. В состав большинства систем ВЖХ входят предварительные колонки, предохраняющие от порчи более крупные и дорогостоящие разделяющие колонки. Для предварительных колонок часто используют тот же наполнитель, что и для основных. В случае ОФ-ВЖХ разделения проводили и просто на одних предварительных колонках (Bhown, Bennett, 1984).
5. Детекторы и коллекторы фракций
Для белков большинство детекторов регистрирует поглощение УФ-света или флуоресценцию. Имеются разнообразные ультрафиолетовые детекторы, работающие в сканирующем режиме, а также детекторы с изменяемой или фиксированной длиной волны. Коллектор фракций для ВЖХ должен работать достаточно быстро, чтобы «успевать» за высокой скоростью элюции; имеется много типов пригодных для этих целей коллекторов фракций.
III. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ вжх для очистки
И ИССЛЕДОВАНИЯ ИММУНОГЛОБУЛ ИНОВ-
А. Общие замечания
В нашей лаборатории методы ВЖХ используют для очистки и изучения структуры и функции иммуноглобулинов. Ниже приведены детальные описания применяемых вариантов ВЖХ и примеры их использования. ГП-ВЖХ применяют для разделения легких и тяжелых цепей антител после восстановления и ал-килирования. Этот метод используют также для очистки фрагментов антител после их химического расщепления. ОФ-ВЖХ применяют для пептидного картирования антител. Мы обсудим в этой главе способы улучшения разделения пептидов и повышения чувствительности их детектирования, а также новый вариант очистки моноклональных антител в мягких условиях с помощью ГА-ВЖХ. Этот метод имеет ряд преимуществ, которые помогут повысить чистоту препаратов моноклональных антител.
