Иммунологические методы исследований - Лефковитса И.
ISBN 5-03-0011-70-6
Скачать (прямая ссылка):
Shivelti J. E.. ed. (1985). Microcharacterization of Polypeptides, Humana Press, Clifton, New Jersey, in press.
Stanleu E. R., Guilbert L. J. (1981). J. Immunol. Methods, 42, 253—284.
Stein S., Udenfried S. (1984). Anal. Biochem., 136, 7—23.
Stern A. S., Pan Y.-C. E., Urdal D. L.. Mochizuki D. Y.. DeChiara S., Blacher R„ Wideman J., Gillis S. (1984). Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A’, 81, 871 — 875.
Symposium Abstracts (1984). Int. Symp. HPLC Proteins, Peptides, Polynucleotides, 4th, Dec. 10—12, Baltimore.
Tarr G. E.. Crabb J. W. П983). Anal. Biochem., 131, 99—107.
TSK-Gel Bibliography (1983). Biochemistry, Aug. (Tokyo Soda Mfg. Co.).
Глава 7
Высокоэффективная жидкостная хроматография иммуноглобулинов
Джеффри У. Хенсон
I. ВВЕДЕНИЕ
Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЖХ) в течение последних лет принята на вооружение во многих биохимических лабораториях. Биохимики, работающие с белками, мало применяли ВЖХ в силу ряда причин как технического, так и принципиального характера. Даже после того, как были преодолены основные технические трудности, широкому применению ВЖХ для фракционирования белков препятствовали два момента. Первый момент имеет отношение к другому названию высокоэффективной жидкостной хроматографии, которое использовали на равных правах с первым, — «жидкостная хроматография при высоком давлении» (ЖХВД). Это название, оправданное для техники, применявшейся несколько лет назад, в настоящее время устарело, так как благодаря улучшению матриц в большинстве систем ВЖХ, предназначенных для белковой химии, удается использовать невысокие давления. Многие исследователи в области белковой химии считали! что белки, подвергнутые высоким давлениям, теряют активность. Второй момент, препятствующий широкому применению ВЖХ для фракционирования белков, связан с тем, что для элюции белков с колонок для ВЖХ необходимы буферы или органические растворители, которые оказывают на них сильное денатурирующее воздействие. И в данном случае благодаря появлению улучшенных матриц, используемых для таких типов ВЖХ, как гель-проникающая хроматография (ГП-ВЖХ), ионообменная хроматография (ИО-ВЖХ) и хроматография на гидрокси-апатите (ГА-ВЖХ), это представление оказалось ошибочным. Для хроматографии в обращенных фазах, или обратнофазовой хроматографии (ОФ-ВЖХ; обсуждение см. ниже), применение органических растворителей является необходимым, однако потеря ферментативной или биологической активности при этом (Rubinstein et al., 1979; Anzano et al., 1982; Titani et al., 1982, Roitsch, Barnes, гл. 6 этой книги) или потеря антигенных свойств, т. е. разрушение структуры, вовсе не обязательны (Alvarez et al., 1981).
134 Глава 7
Таким образом, улучшенные матрицы, наличие разнообразных колонок и увеличение их емкостей дают возможность исследователям в области иммунохимии использовать присущие ВЖХ высокую чувствительность, хорошее разрешение и быструю элюцию. В этой главе будут детально обсуждены три типа хроматографических разделений, используемых в нашей лаборатории для очистки иммуноглобулинов и изучения их структуры. Речь пойдет о методах ГП-ВЖХ, ОФ-ВЖХ и ГА-ВЖХ.
II. ВЖХ: ТЕОРИЯ, ПРАКТИКА И ОБОРУДОВАНИЕ
А. Теория
Разделение молекул при жидкостной хроматографии достигается за счет их распределения между подвижной фазой (растворителем) и стационарной фазой (матрицей колонки). Если молекулы вещества X в большей степени связываются с матрицей, чем молекулы вещества Y, то вещество Y будет элюироваться с колонки раньше, чем вещество X. В случае гель-прони-кающей хроматографии (ГПХ) стационарная фаза представляет собой пористые гранулы. Здесь разделение молекул достигается за счет того, что поры дифференциально замедляют движение веществ в колонке. Некоторые низкомолекулярные вещества полностью входят в поры гранул носителя, другие, более крупные, входят только частично или совсем не входят. Молекула Б, более крупная, чем молекула А, будет элюироваться с колонки раньше, чем молекула А. Все молекулы, которые не входят в поры гранул носителя, сойдут с колонки в той порции элюата, которая называется исключенным (или свободным) объемом (Vo). Все другие молекулы будут элюироваться с колонки в зависимости от их размера. Самые маленькие молекулы, способные входить в поры носителя без какого-либо взаимодействия с ним, элюируются объемом растворителя, который называют полным объемом Vt.
Другие варианты жидкостной хроматографии также основаны на различиях в равновесных распределениях разделяемых молекул между стационарной и подвижной фазами. В случае обратнофазовой жидкостной хроматографии (ОФХ) стационарной фазой является твердый носитель с пришитой органической (неполярной) группой. Вещества связываются с носителем благодаря сродству к этим неполярным группам. Таким образом, здесь степень связывания фракционируемых веществ с носителем обусловлена их гидрофобными свойствами. Обычно пришивают линейные алкильные углеводородные цепи, хотя иногда используются и фенильные, и дифенильные группы. Длина алкильных цепей варьирует от 2 до 18 атомов углерода. При хроматогра-
