Иммунологические методы исследований - Лефковитса И.
ISBN 5-03-0011-70-6
Скачать (прямая ссылка):
— модифицированная среда Хогнесса (от англ. Hogness modified freezing medium)
— иммуноглобулины
— главный комплекс гистосовместимости
— среда, имеющая состав: 50 мМ трис-НС1,
pH 8, 5 мМ ЭДТА, 150 мМ NaCl,
0,5%-ный тритон Х-100
— среда, имеющая состав: 50мМ трис-НС1, рН8, 5 мМ ЭДТА, 150 мМ NaCl, 1 мг/мл овальбумина, 0,5% -ный тритон Х-100
— среда, имеющая состав: 50 мМ трис-НС1, рН8, 5 мМ ЭДТА, 650 мМ NaCl, 0,5%-ный тритон Х-100
— нонидет Р-40
— стандартный раствор цитрата (0,15 М NaCl, 0,015 М Na-цитрэт, рН7)
— культуральная среда для выращивания клеток WEHI-3
Глава 1
Методы,
применяемые в молекулярной иммунологии: «прогулка вдоль хромосомы» в области главного комплекса гистосовместимости
М. Стейнметц, Д. Стефен,
Г. Р. Дастурнику, Э. Джибб и Р. Романюк
I. ВВЕДЕНИЕ
Главный комплекс гистосовместимости (МНС от англ. major histocompatibility complex) —это большой участок хромосомы, который кодирует молекулы, представляющие интерес как для биолога, так и для врача. Эти молекулы играют важную роль в формировании иммунного ответа в организме млекопитающих, они определяют конечный результат, получаемый при пересадке тканей, и имеют прямое отношение к некоторым заболеваниям. На протяжении 50 лет гены МНС и детерминируемые ими молекулы исследовали с помощью серологических и биохимических методов. В последнее время выделение клонов кДНК, соответствующих генам МНС, ознаменовало собой начало интенсивного исследования генов МНС на молекулярном уровне. Успехам в молекулярном анализе генов МНС у мыши особенно способствовало выделение больших фрагментов ДНК с использованием систем клонирования в космидах. Из космид-ной библиотеки ДНК мышей линии BALB/c было получено 60 космидных клонов, кодирующих 36 неидентичных генов класса I; эти гены удалось сгруппировать за счет перекрывания рестрикционных карт в 13 генных кластеров класса I (Steinmetz et al., 1982а). Размер указанных кластеров составляет от 35 до 191 kb ДНК, причем каждый из них содержит от 1 до 7 генов класса I. К тому же выделение космидных клонов с использованием кДНК-зондов, относящихся к классу II, в сочетании с экспериментами типа «прогулка по хромосоме» дало возможность охарактеризовать целый район ДНК длиной более 200 kb, примыкающий к области I МНС (Steinmetz et al., 1982b). При этом было сделано несколько важных наблюдений, включая открытие горячей точки рекомбинации в середине гена, относящегося к классу II, были обнаружены не известные ранее гены класса II, был идентифицирован участок хромосомы в районе I, обладающий гипермутабильностью, и были получены доказатель-
Ме-Годы, применяемые в молекулярной иммунологии
17
ства, свидетельствующие против существования двух ранее предсказанных подрайонов, обозначавшихся I-В и I-J (Stein-metz et al., 1982b, 1984). Опыты по клонированию в космидах и опыты типа «прогулка вдоль хромосомы» использовались также для характеристики районов хромосомы, содержащих гены класса I, у мышей линии C57BL/10 (Weiss et al., 1984). К тому же данный подход применим для характеристики МНС, кодирующего гены класса III как у мыши, так и у человека (Chaplin et al., 1983; Carroll et al., 1984; Steinmetz et al., 1984). Таким образом, в настоящее время МНС является наиболее детально исследованным участком хромосом млекопитающих.
В этой главе мы подробно опишем методы, используемые нами в настоящее время для конструирования и скрининга кос-мидных библиотек, а также для опытов типа «прогулка вдоль хромосомы». «Прогулка вдоль хромосомы» определяется как метод, используемый для выделения фрагментов ДНК, соседних с данным районом клонированной ДНК В большинстве случаев такая «прогулка» осуществляется с помощью скрининга геномных библиотек, полученных из частично гидролизованной ДНК, с использованием меченого уникального рестрикционного фрагмента, выделенного из концевой области клонированного района. Таким образом получают клоны, содержащие перекрывающиеся фрагменты ДНК, и после рестрикционного картирования и соответствующей ориентации фрагментов материал этих клонов может использоваться для продолжения такой «прогулки».
II. МАТЕРИАЛЫ
Маркерные фрагменты бактериофага Я. Проводят полный гидролиз проб по 100 мкг ДНК бактериофага Я с помощью рестриктаз ?coRI, Sail, Smal и //mdlll. Гидролизаты проверяют на мини-геле с концентрацией 0,6% (Maniatis et al., 1982). Если гидролиз прошел полностью, к каждому гидролизату добавляют равный объем фенола, объединяют четыре гидролизата и добавляют 50 мкг негидролизованной ДНК фага %. Перемешивают на вортексе, удаляют фенол и осаждают ДНК этанолом. Растворяют материал в 800 мкл ТЭ-бу-фера и хранят при —20 °С. При использовании раствор разбавляют в 10 раз буфером для нанесения двукратной концентрации (Maniatis et al., 1982; тип II) и хранят при 4°С (на одну дорожку геля наносят 5—20 мкл)
Севаг: смесь хлороформ — изоамиловый спирт (24:1)
Фенол: готовят по Маниатису и др. (Maniatis et al., 1982)
ТЭ-Буфер: 10 мМ трис-НС1, pH 8, 1 мМ ЭДТА
10%-ная сахароза: 100 г сахарозы в 1 л (окончательный объ-
