Иммунологические методы исследований - Лефковитса И.
ISBN 5-03-0011-70-6
Скачать (прямая ссылка):
3. Оценка количественных определений
Для количественной оценки белка при ВЖХ использовали следующие белки: цитохром с (лошадь; Serva), ингибитор трипсина (соевые бобы; Serva), лизоцим (куриное яйцо; Sigma), рибонуклеазу А (бык; Pharmacia), каталазу (бык;
Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЖХ)
125
Pharmacia) и трансферрин (человек; Behringwerke). Фирмы — изготовители БСА, карбоангидразы, овальбумина и тироглобу-лина указаны выше. Препараты стандартных белков элюировали с колонки 10-мкм Aquapore RP300, используя системы 3 и 4 [модифицированный градиент растворителя Б (0—60%), 30 мин] или 6 (разд. V, Б).
В. Определение по УФ-поглощению при 280 и 205 нм
Площадь пиков для данного количества белка определяли, умножая высоту пика на его ширину на уровне, соответствующем половине высоты пика. Площади пиков, измеренные для разных белков в различных растворителях, усредняли, а затем строили калибровочные кривые для данной длины волны, откладывая по одной оси средние значения площади пиков, а по другой количество наносимого на колонку белка. Анализ данных показал, что соотношение площади пиков и количества нанесенного белка линейно как при 280 нм, так и при 205 нм; этого следовало ожидать, исходя из закона Ламберта — Бэра.
Г. Сравнение ошибок при количественном определении белка
по поглощению УФ-света и колориметрическими методами
Ошибки измерений количества белка по поглощению в УФ-области (при определении площади пиков на профиле элюции) были оценены для 10 различных белков. Каждый из белков (10 мкг) хроматографировали на колонке 10-мкм Aquapore RP300, определяли площадь пиков, а затем количество белка по калибровочным кривым (разд. VI, В), причем предполагалось, что выход белка составляет 100%. Ошибки в определении, которые можно было ожидать для каждого белка, исходя из его коэффициента экстракции, сопоставляли с реальными ошибками для каждого определения (табл. 6-1). Реально полученные значения ошибок отражают в основном потери белка при хроматографии. Оценки выхода белка, сделанные по количественным определениям при обоих длинах волн, хорошо совпадали для БСА, карбоангидразы Б, каталазы и цитохрома с (разница <11%). Для остальных белков различия выхода составляли 25—54%. Небольшие расхождения значений могут иметь место из-за небольших неточностей при определении площадей пиков. Более значительные несоответствия могут объясняться различиями коэффициентов экстинкции белков в растворителях, используемых для элюции (НС1/2-пропанол или ТФК/ацетонит-рил, pH 2), и в 12 мМ НС1, pH 2.
Полученные в реальных экспериментах ошибки сравнивали
Таблица 6-1. Количественное определение белка при ВЖХ по УФ-поглощению и по данным колориметрических измерений
Определение белка по А2ов Определение белка по АМо i S
Белок о Ожидаемая Реальная ? Ожидаемая Реальная Ошибка для Ошибка для м Ошибка для м
in 5-, ошибка, % ошибка, % О ошибка, % ошибка, % биуретового тода Лоури, % тода Бредфор;
S о" гг метода, % %
bj ОО .
сч о
Uj
Бычий сывороточный альбумин 29,7 0 --- 13 0,60 ---41 -43 -3 ---16 +ш
Карбоангидраза Б человека 30,8 +3 +9 1,38 +36 +38 --- 12 ---и +30
Бычья каталаза 30,3 +2 --- 15 1,10 +8 -22 -24 ---37 -3
Цнтохром с лошадн 29,0 -3 -9 1,74 +71 +87 + 157 + 13 + 153
Лизоцим нз куриных яиц 39,5 +32 +22 3,30 +225 + 176 +4 +26 -1
Овальбумин нз куриных яиц 32,1 +8 -31 0,68 -49 ---51 +2 + 1 -6
Бычья рибонуклеаза А 27,3 -8 -21 0,81 -20 -58 + 18 +59 ---47
Бычнй тироглобулин 28,1 ---6 -23 1,20 + 18 ---53 ---23 -18 ---7
Трансферрин человека 34,0 -'-14 +28 1,05 +3 -23 --- 15 --- 10 +26
Ингибитор трипсина из сон 31,5 +6 -27 0,86 -30 -32 -9 +3 ---39
Среднее отклонение (%) +5 ---8 +22 +2 + 10 + 1 +22
Средний модуль отклонения 8 20 50 58 27 19 42
