Иммунологические методы исследований - Лефковитса И.
ISBN 5-03-0011-70-6
Скачать (прямая ссылка):
5. Препаративное выделение
Для препаративной работы методы ионообменной хроматографии имеют преимущество перед другими ее вариантами. Для полупрепаративных целей при внесении 10—50 мг белка (если перегрузка не мешает разрешению выделяемых компонентов) могут быть использованы даже аналитические колонки для ВЖХ (4,1X250 мм). На колонке 10X300 мм проводили препаративное фракционирование 400 мг белка, и, вероятно, разделения граммовых количеств веществ реальны на колонках 40x150 мм (Regnier, 1983). В препаративных масштабах с успехом использовали ионообменную колонку 22X500 мм (Baker-bond, МАЬ; зарегистрированная торговая марка фирмы Baker) для одноэтапного выделения моноклональных антител из асцитной жидкости. При этом удавалось получать 548 мг антител после одного разделения или ~4,4 г антител в день (Dorfman,
1984).
Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЖХ)
113
Б. Хроматография на гидроксиапатите
1. Введение
Для фракционирования белков по заряду наряду с ионообменными носителями используется и гидроксиапатит (Gorbu-noff, Timasheff, 1984). Хотя механизм связывания белков с гид-роксиапатитом зависит от заряда, он отличается от механизма связывания с ионообменными носителями, и поэтому гидроксиапатит характеризуется иной селективностью при разделении белков.
2. Реагенты и условия элюции
Колонка: 7,8x100 мм BioGel НРНТ (BioGel — зарегистрированная торговая марка фирмы Bio-Rad Laboratories, Глатт-бруг, Швейцария)
Подвижная фаза: растворитель А: 0,01 М фосфат натрия, pH 6,8, 0,3 мМ СаСЬ; растворитель Б: 0,35 М фосфат натрия, pH 6,8, 0,01 мМ СаС12
Элюция: линейный градиент растворителя Б (0—100%), 30 мин
Скорость потока: 1,0 мл/мин Выявление: по поглощению при 280 и 205 цм Образец: перед внесением проводят диализ против растворителя А
Примечания. Носитель в колонках НРНТ более хрупкий, чем носитель на основе силикагеля в колонках для ВЖХ. Чтобы не повредить его при избыточном давлении, рекомендуется четко соблюдать все инструкции, предписываемые фирмой-изго-товителем.
3. Использование для очистки МГФР
Колонка для ВЖХ с гидроксиапатитом была с успехом использована для получения высокоочищенного МГФР мышей с хорошим выходом и высоким разрешением. Данные, представленные на рис. 6-3, показывают, что пик биологической активности отделяется от основной части белка в образце, который уже прошел шесть стадий очистки, включая обычную ионообменную и обратнофаэовую хроматографию и разделение по размерам с помощью ВЖХ (разд. VII). Основная активность, стимулирующая гранулоциты, макрофаги и эритроциты (ГМЭ, 3,1 • 105 ед./мг), связана с 3,8 мкг белка, как было установлено по поглощению при 280 нм, однако фракция этого белка не
8—1278
114 Глава 6
Объем элюата, мл
Рис. 6-3. Хроматография МГФР на гидроксиапатитной колонке BioGel НРНТ, Исходный препарат, полученный из 20 л среды, кондиционированной клетками WEHI-3B (D~), подвергали обработке на шести предварительных этапах, а затем наносили на колонку НРНТ в 0,01 М фосфатном буфере, pH 6,8, 0,3 мМ СаС12 (буфер А). Фракции элюировали линейным градиентом буфер А—0,35 М фосфатный буфер, pH 6,8, 0,01 мМ СаС12. В течение 30 мин с колонки была элюирована активность, связанная с 3,8 мкг белка (по данным поглощения при 280 нм).
гомогенна: она содержит менее 1 мкг активного белкового компонента.
При элюции с колонки МГФР сходил в виде одиночного пика в начале градиента фосфата натрия. Однако показано, что при использовании колонок BioGel НРНТ профили элюции эритропоэтина мышей и эритропоэтинподобной биологической активности существенно отличались друг от друга и от профиля элюции МГФР (Fagg, Roitsch, 1985). Таким образом, этот носитель сыграл важную роль в выявлении свойств этих биологически активных веществ. Анализ эритропоэтина был проведен с использованием всего ~5 ед. биологической активности, что соответствует примерно 70 нг активного белка, который был получен из 0,4 мл сыворотки мышей, больных анемией.
4. Общие замечания
для аналитического варианта разделения
Аналитическая колонка с гидроксиапатитом, предлагаемая фирмой Bio-Rad, весьма эффективна при получении свободного от протеаз препарата иммуноглобулинов из асцитной жидкости мышей, причем его выделение включает одну стадию очистки и продолжается всего 30 мин (Juarez-Salinas et al., 1984). Фракционирование иммуноглобулинов на этих и других матрицах
Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЖХ)
115
для ВЖХ описано в гл. 7. Колонка с сорбентом BioGel НРНТ была с успехом использована при выделении биологически активного интерлейкина-1 (Kock, Luger, 1984).
5. Препаративное выделение
Как и в случае ионообменных носителей, условия элюции при фракционировании на гидроксиапатитных колонках относительно мягкие, а емкость по белку высокая. Емкость колонки BioGel НРНТ по общему белку составляет 100 мг.
V. РАЗДЕЛЕНИЕ ПО ГИДРОФОБНЫМ СВОЙСТВАМ: ОБРАТНОФАЗОВАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ
А. Введение
Хотя при обратнофазовой (в обращенных фазах) ВЖХ белков необходимо использование денатурирующих растворов с низким pH и органических растворителей в высоких концентрациях, она приобрела в последние годы большую популярность. Основные достижения в этой области рассмотрены в специальных обзорах (Alvarez et al., 1981; Regnier, 1983). При работе с некоторыми недавно созданными матрицами для ВЖХ на основе силикагеля могут использоваться мягкие условия элюции, приближающиеся к тем, которые применяются для разделений по гидрофобным свойствам на обычных носителях (Kato et al.f 1983; Fausnaugh et al., 1984; Gooding et al., 1984).
