Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Лефковитса И. -> "Иммунологические методы исследований" -> 41

Иммунологические методы исследований - Лефковитса И.

Лефковитса И., Перниса Б. Иммунологические методы исследований — М.: Мир, 1988. — 530 c.
ISBN 5-03-0011-70-6
Скачать (прямая ссылка): immunologicheskiemetodi1988.djvu
Предыдущая << 1 .. 35 36 37 38 39 40 < 41 > 42 43 44 45 46 47 .. 239 >> Следующая

Д. Переход к препаративному разделению
Гель-проникающая хроматография часто используется как для аналитических, так и для препаративных целей, однако последний вариант осложнен значительными трудностями. На колонке TSK Gel 3000 SW (7,5x300 мм) без значительной потери разрешения можно разделять образцы, содержащие не более 700 мкг белка в 150—200 мкл (Regnier, 1983). Вместе с тем при использовании аналитических колонок для обратнофазовой или ионообменной ВЖХ можно разделять в 5—10 раз большие количества белка. Решение проблемы количества наносимого белка облегчается тем, что большинство носителей для ВЖХ по размеру выпускаются в виде колонок, готовых для полупрепаративного разделения. На колонке TSK Gel 3000 SW диаметром 21,5 мм можно разделять до 100 мг белка (инструкция фирмы TSK).
IV. РАЗДЕЛЕНИЕ ПО ЗАРЯДУ:
ХРОМАТОГРАФИЯ НА ИОНООБМЕННЫХ НОСИТЕЛЯХ И ГИДРОКСИАПАТИТЕ
А. Ионообменная хроматография (ИОХ)
1. Введение
Ионообменные носители для ВЖХ белков в некотором отношении аналогичны обычным матрицам: 1) существуют как слабые, так и сильные анионо- и катионообмецники; 2) их связы-
110 Глава 6
вающие свойства подобны свойствам сорбентов, используемых в обычной хроматографии. Чаще других используют крупнопористый (300 А) слабый анионообменник SynChropak АХ300 на основе связанного с полиаминами силикагеля (Regnier, 1983). Поскольку большинство белков, упоминаемых в литературе, имеют значения pi<8 (Righetti et al., 1981), анионообменники применяют более широко, чем катионообменники (Gupta et al.,
1983).
2. Реагенты и условия элюции
Колонка: SynChropak АХ300 (4,1x250 мм; SynChropak —
зарегистрированная торговая марка SynChrom Inc., Линден, Индиана, США)
Подвижная фаза: растворитель А: 50 мМ трис-НС1, pH 7,0; растворитель Б: 50 мМ трис-НС1, pH 7,0, 1 М NaCl
Элюция: изократическая, в течение 25 мин растворителем А; затем 30 мин линейным градиентом 0—100% растворителя Б Скорость потока: 0,5 мл/мин Выявление: по поглощению при 280 и 205 нм Образец: перед внесением в колонку образец диализуют против растворителя А
Примечания. После внесения образца колонку промывают как минимум трехкратным объемом или до тех пор, пока поглощение не достигнет исходного уровня, и только после этого начинают градиентную элюцию. Скорость потока может быть увеличена до 1,0 мл/мин без каких-либо отрицательных последствий для разделения.
3. Использование ИОХ для сравнения КСФ из двух источников
На колонке SynChropak АХ300 было проведено сравнение ионообменных свойств колониестимулирующих факторов (КСФ) из двух источников в аналитическом варианте (рис. 6-2) (Corbel, 1983). Среду, кондиционированную Т-клеточной гибридо-мой (BWXV3) 25-7-D4 или клетками WEHI-3B (D-), концентрировали на мембранах Amicon YM-10 до объема 1,7 мл, диали-зовали и хроматографировали, как описано выше. Фракции элюата (1 мл) стерилизовали фильтрованием (фильтры с размером пор 0,45 мкм) и определяли в них активность КСФ, ИЛ-2 и фактора, заменяющего В-клетки, в присутствии d-a-метилман-нозида. Биологически активный белок, синтезируемый клетками гибридомы, связывался с анионообменником, в то время как КСФ из клеток WEHI-3B (D-) не задерживался на колонке. Это свойство КСФ клеток WEHI-3B (D-) проявлялось и на
s
-20 ±
20
¦ -10 s
Рис. 6-2. Фракционирование с помощью анионообменной хроматографии на колонке SynChropak АХ300 КСФ из двух источников. А. 100 мл среды, кондиционированной Т-клеточной гнбридомой (BWXV3) 25-7-D4 (Corbel, 1983), концентрировали до объема 1,7 мл, диализовали против буфера для нанесения (50 мМ трнс-НС1, pH 7,0), вносили в колонку и элюировали линейным градиентом от 0 до 1 М NaCl в буфере для нанесения в течение 30 мин. Фракции объемом 1 мл стерилизовали фильтрованием (размер пор 0,45 мкм) и определяли активность КСФ (кружки), ИЛ-2 (светлые квадратики) и заменяющего В-клетки фактора (темные квадратики) в присутствии d-a-метилман-нозида. Б. 100 мл среды, кондиционированной клетками WEHI-3B (D-), готовили и хроматографировали так же, как в случае А. Фракции исследовали на активность КСФ (кружки).
112 Глава 6
матрицах для обычной хроматографии; оно уже было использовано при крупномасштабных выделениях (Iscove et al., 1982).
Хотя на колонку наносили >20 мг белка, в каждом случае его содержание в элюируемой активной фракции составляло нанограммы.
4. Общие замечания для аналитического варианта
разделения
Как и в других случаях, при разделении крупных белков критическим фактором является размер пор ионообменника. Показано, что анионообменники с размером пор до 4000 А применимы для хроматографии белков, имеющих мол. массу 200 000—400 000 (Regnier, 1983).
Раньше отдавали предпочтение слабым ионообменникам, но теперь показано, что сильный аниоиообменник Mono Q (зарегистрированная торговая марка фирмы Pharmacia) и сильный катионообменник Mono S (зарегистрированная торговая марка фирмы Pharmacia) обладают рядом преимуществ. Они характеризуются более высокой разрешающей способностью, более легко прогнозируемым временем задержки веществ и лучшим выходом белков, чем использовавшиеся ранее матрицы на основе силикагеля (Kopaciewicz, Regnier, 1983). Эти новые анионообменники созданы на основе гидрофильной полиэфирной смолы (Richey, 1982) и имеют дополнительное преимущество: они устойчивы в широком диапазоне pH (2—12). Силика-гельные матрицы используются только при pH <8, при больших значениях pH силикагель растворим.
Предыдущая << 1 .. 35 36 37 38 39 40 < 41 > 42 43 44 45 46 47 .. 239 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed