Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Лефковитса И. -> "Иммунологические методы исследований" -> 36

Иммунологические методы исследований - Лефковитса И.

Лефковитса И., Перниса Б. Иммунологические методы исследований — М.: Мир, 1988. — 530 c.
ISBN 5-03-0011-70-6
Скачать (прямая ссылка): immunologicheskiemetodi1988.djvu
Предыдущая << 1 .. 30 31 32 33 34 35 < 36 > 37 38 39 40 41 42 .. 239 >> Следующая

3) Этапы 3 и 4 в атмосфере аргона, иа этапе 4 кран закрывают^
4) Промывают до исчезновения коричневой окраски.
5) Этапы 5, 7 и 8 можно проводить, используя ацетонитрил.
Таблица 5-2. Триэфирный цикл1’
Добавление реагентов (этап) Цель Объем, мл Время, мин
1. Дихлоруксусная кислота Детритилирование 3-1,5 3-0,5
(3%-ная) в дихлорэтане
2. Дихлорэтан Промывка 3-1,5 1
3. Пиридин (безводный) 2-1,5 2-1
4. Пиридин (безводный) » 2-1,5 2-22>
5. Смесь для конденсации Элонгация цепи 1 202>
•6. Пиридин Промывка 3-1,5 2
7. Дихлорэтан » 3-1,5 1
¦) Ti et al., 1982.
2) Этапы 4 и 5 в атмосфере аргона, на этапе 5 кран закрывают.
де синтеза олигонуклеотидов химические реакции постоянно повторяются, при этом используются только четыре типа мономерных блоков и один связывающий реагент. Продолжительность реакций для различных нуклеотидов почти одинакова, а для отмывки используется всего несколько растворителей.
Таким образом, автоматизировать нужно только три процесса: 1) дозирование и подачу реагентов; 2) смешивание реагентов и подачу их в реакционные камеры; 3) промывку.
Из за-высокой реакционной способности химических веществ, используемых в синтезе, выбор материалов для конструирования синтезаторов весьма ограничен — это стекло, тефлон, нержавеющая сталь.
Методические подходы к синтезу олигонуклеотидов
97
В приведенной ниже таблице представлены варианты автоматизации основных этапов в синтезаторах разных типов:
1. Дозирование реагентов
2. Реакционные камеры (смешивание)
Краны для распределения растворителей и реагентов
3. Промыика
Петли определенного объема из тефлоновых трубок; способ подачи: под давлением аргона Шприцы
Пневматические (давление воздуха) Механические (шаговый мотор)
Колонки
Поток сжатого аргона; необходимо предварительное перемешивание Камеры
Поток снизу или сверху
Предварительное перемешииаиие реагентов или последовательное добаиление и смешивание в камере Поворотные, многоходовые, электрические или пневматические Соленоидные
Стопорные краны (работающие под действием давления или благодаря вакууму)
Свободный поток (давление аргона)
Автоматические бюретки
Насосы
«Мозгом» такого синтезатора могут служить простые электронные схемы в полуавтоматических системах (автоматизация только цикла промывки) или микропроцессоры с памятью до 30 кбит в полностью автоматизированных приборах, таких как, например, синтезатор, показанный на рис. 5-8.
III. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
А. Функционализация стеклянного носителя
Стеклянный носитель фирмы Pierce не нуждается в какой-либо предварительной обработке. Его можно сразу же использовать для функционализации соответствующим З'-сукцинили-рованным нуклеозидом. 3 г носителя суспендируют в 50 мл абсолютного пиридина и 0,9 мл триэтиламина, а затем растворители упаривают. После добавления 2,5 ммоль З'-сукцинилиро-ванного нуклеозида в пробу вносят 50 мл пиридина, 22 ммоль (4,5 г) ДЦК и 0,5 ммоль (61,2 мг) ДМАП. Смесь инкубируют 24 ч с периодическим встряхиванием на вортексе. Затем ее фильтруют через стеклянный фильтр, промывают пиридином и эфиром и высушивают в вакууме.
После этого носитель ресуспендируют в 30 мл пиридина с добавлением 3 мл уксусного ангидрида и ведут реакцию 2 ч. Суспензию опять фильтруют через стеклянный фильтр, носи-
7—1278
9 8 Глава 5
Рис. 5-8. Полностью автоматизированный синтезатор с микропроцессором.
тель с присоединенным нуклеозидом промывают пиридином и эфиром и высушивают в вакууме. При функционализации со 100 мг носителя связывается 1—3 мкмоль нуклеозида.
Б. Отщепление цианэтильной группы от триэфиров мономеров
и димеров и подготовка к этапу конденсации на носителе
В маленькой грушевидной колбе (5 мл) готовят раствор
0,06 ммоль триэфира мономера или димера (50—60 мг в случае мономера, 75—90 мг в случае димера) в 1,2 мл пиридина и добавляют 0,3 мл грег-бутиламина. За реакцией следят с помощью тонкослойной хроматографии [силикагельные пластины, хлороформ — этанол (9:1), Rf диэфира = 0] и обычно реакцию прекращают через 15 мин. С мономерами реакция протекает медленнее, чем с димерами.
Раствор упаривают, а осадок растворяют в малом объеме пиридина и снова упаривают. Колбу закрывают пленкой, в которую вводят иглу от медицинского шприца. Эту процедуру проделывают со всеми блоками, которые предполагается использовать для синтеза требуемой олигонуклеотидной последовательности. На ночь колбы помещают в эксикатор с хлористым кальцием в высокий вакуум. МСНТ, необходимый для всех этапов конденсации данного синтеза, также высушивают в эксикаторе.
Методические подходы к синтезу олигонуклеотидов
99
Эксикатор заполняют сухим аргоном. Иглы вынимают и МСНТ, содержащийся в колбе на 10 мл (417 мг), растворяют под аргоном в 9 мл безводного пиридина.
Предыдущая << 1 .. 30 31 32 33 34 35 < 36 > 37 38 39 40 41 42 .. 239 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed