Иммунологические методы исследований - Лефковитса И.
ISBN 5-03-0011-70-6
Скачать (прямая ссылка):
2. З'-Фосфоамидиты
Чаще других используются диизопропиламино- или морфо-линоамидиты. Мы предпочитаем работать с морфолиноамиди-тами, которые синтезируются по схеме, показанной на рис. 5-5 (McBride, Caruthers, 1983).
Осн q _ Осн
дмто-|^'°\| + сн3о-р^^\ chci3 дмто-|^°\|
он
I
Л / \ сн3о n о
Рис. 5-5.
Образующиеся после экстракции и осаждения амидиты обычно имеют степень чистоты, достаточную для того, чтобы уровень связывания достигал ~95%. Это соответствует синтезу олигонуклеотидов вплоть до двадцатичленных. Для повышения выхода связывания морфолиноамидиты следует подвергать более тщательной очистке с использованием хроматографии на коротких колонках.
Д. Удаление защитных групп
После завершения синтеза олигонуклеотид в полностью защищенной форме связан с полимерным носителем. На рис. 5-6, А и Б показано, как следует соответственно отщепить защитные группы и снять олигонуклеотидную цепь с носителя.
И в том и в другом методе синтеза после образования олигонуклеотида прежде всего удаляют защитную группу фосфатного остатка; правда, оксимат вызывает отщепление от носителя и олигонуклеотида. При фосфитном методе обработка аммиаком необходима для отщепления защитных групп от экзо-циклических аминогрупп и олигонуклеотида от носителя. Пос-
94 Глава 5
дмт о-
ХУ
1)
2) NH3
0-C-CH?-CHo-C-NHWAr НКП II г * \\
о о
мо2
1) <^»-CH=N-O0
2) NH3
3) НОАс
О—С—CH?—СИ?—С—NH^Vvw НКП II г II
о о
Б
Рис. 5-6.
UCV
V51 3) НОАс _ ' Осн-,
п Пр
п
0 Осн _®о-р=о _
1 on
н3со-р=о
0-1 „о.
п—I
чр
он
Осн
тр
=о
Осн
но
о
ео-р=о
ео4=о J
_. иен
тр
ле завершающей обработки уксусной кислотой (удаление ди-метокситритильных групп) получают незащищенные нуклеотиды. Для получения чистого препарата синтезированных олигонуклеотидов смесь необходимо очистить соответствующими методами.
Е. Синтез вручную на полимерном носителе
Для синтеза на твердых носителях вручную используются приборы нескольких типов. Простая, но очень удобная установка показана на рис. 5-7. Воронку со стеклянным фильтром заполняют полимерным носителем, на котором фиксирован первый нуклеотид с З'-конца синтезируемой олигонуклеотидной последовательности. Носитель, нагруженный 1—3 мкмоль нуклеотида, промывают 4,5 мл дихлорэтана. После этого 3%-ным раствором дихлоруксусной кислоты в дихлорэтане (последний необходим для предотвращения возможной апуринизации) отщепляют диметокситритильную группу. Детритилирующий
Методические подходы к синтезу олигонуклеотидов
95
Рис. 5-7. Простой и удобный аппарат для синтеза вручную на твердых носи* телях.
раствор собирают в пробирку для оценки выхода. Все растворы и реагенты добавляют пастеровскими пипетками и удаляют отсасыванием.
До стадии конденсации установку запечатывают пленкой ч держат под небольшим положительным давлением аргона. Носитель высушивают многократным добавлением безводного пиридина (триэфирный метод) или ацетонитрила (фосфитный метод). Кран закрывают и добавляют смесь для конденсации (З'-диэфир + МСНТ) или активированный амидит (амидит+тет-разол). После этого пленку снимают и добавляют реагенты для последующих стадий пастеровскими пипетками. Циклы добавления нуклеотидных блоков приведены для обоих методов в табл. 5-1 и 5-2.
Ж. Синтезаторы
Процесс синтеза олигонуклеотидов несложен для автоматизации, и в настоящее время в продаже имеются специальные автоматические приборы — синтезаторы нескольких типов. В хо-
96 Глава 5
Таблица 5-1. Фосфитный цикл1*
Добавление реагентов (этап) Цель Объем, мл Время, мин
1. Дихлоруксусная кислота Детритилирование 3-1,5 3-0,5*)
(3%-ная) в дихлорэтане
2. Ацетонитрил (р. а.) Промывка 2-1,5 2-1
3. Ацетонитрил (безводный) » 2-1,5 2-2s>
4. Активированный амидит Элонгация цепи 0,75% 58>
5. ТГФ Промывка 1.5 1
5. Раствор Ь Окисление 1 3
7. ТГФ Промывка 3-1,5 2«)
8. Дихлорэтан5’ 3-1,5 1
*) Sproat, Bannwarth, 1983.
2) Для более длинных цепей иногда необходимы более продолжительные времена отщепления, в особенности при добавлении цитозина и тимина.
