Иммунологические методы исследований - Лефковитса И.
ISBN 5-03-0011-70-6
Скачать (прямая ссылка):
Norris K., Norris F., Christiansen L., Fiil N. (1983). Nucleic. Acids Res., 11, 5103.
Ochi A., Hawley R. C., Hawley Т., Shulman M. J., Traunecker A., Kohler G., Ho-zumi N. (1983). Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 6351.
Oi V. Т., Morrison S. L., Herzenberg L. A., Berg P. (1983). Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 80, 825.
Rusconi S., Kohler G. (1985). In preparation.
Southern P. J., Berg P. (1982). Appl. Genet., 1, 328.
Глава 5
Методические подходы к синтезу олигонуклеотидов
X. Кифер, В. Банварт
I. ВВЕДЕНИЕ
Благодаря развитию современной генной технологии резко увеличилась потребность в синтетических олигонуклеотидах. В связи с этим возрос интерес к химии их синтеза, что в последние несколько лет привело к возникновению новых идей и методических подходов.
Синтетические олигонуклеотиды используются в качестве линкеров или адапторов для облегчения встраивания ДНК в векторы, затравок для ферментативного синтеза ДНК, а также затравок при секвенировании ДНК и РНК. Их применяют для сайт-направленного мутагенеза и как контрольные элементы для изучения экспрессии генов. Синтетические нуклеотиды используют также для конструирования полных генов. В зависимости от цели использования их длица варьирует от 5 до 60 нуклеотидов. Трудности, возникающие при получении длинных олигонуклеотидов, связаны не с собственно их синтезом, а с очисткой материала.
В настоящее время наиболее перспективным является синтез ДНК с помощью методов твердофазной химии с использованием в качестве твердой фазы пористого стекла. Недавно был предложен привлекательный метод синтеза с применением в качестве твердой фазы целлюлозных фильтров (Frank et al.,
1983). При работе с одним и тем же носителем можно использовать два различных метода синтеза — фосфитный и три-эфирный.
Нуклеотиды защищают по 5'-гидроксилу диметокситритиль-ной группой (ДМТ), а аминогруппы оснований — бензоильными (N-6-A, N-4-C) и изобутирильной (N-2-G) группами. Эфирная группа на З'-конце варьирует в зависимости от того, какой метод синтеза используют: фосфитный или триэфирный.
Отщепление защитных групп и разрыв связей олигонуклеотида с твердой фазой производят поэтапно, а затем полученный материал очищают с помощью препаративного гель-электрофореза или высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЖХ).
Методические подходы к синтезу олигонуклеотидов
89
Синтез олигонуклеотидов или его отдельные этапы могут быть автоматизированы с помощью имеющихся в продаже приборов.
II. ОСНОВНЫЕ ПРИНЦИПЫ СИНТЕЗА
Методы синтеза олигонуклеотидов в растворе используют лишь при получении «блоков» (ди-, тринуклеотидов) для наращивания олигонуклеотидной цепи или больших количеств определенного олигонуклеотида для структурных исследований. В остальных случаях они практически полностью вытеснены твердофазным синтезом, который проводят триэфирным или фосфитным методами.
Твердофазный метод имеет то преимущество, что в нем может быть опущен сложный этап очистки. Вместо этого применяются простые процедуры фильтрования и промывки, что сокращает время, необходимое для синтеза. Более того, твердофазный синтез можно вести в малых масштабах, что дает возможность использовать реагенты в большом избытке, а это в свою очередь заметно увеличивает выход на каждом этапе синтеза.
А. Твердая фаза
В качестве носителей для синтеза олигонуклеотидов используют полимеры, чаще всего полистирол (Ike et al., 1983), полиакриламид (Gait et al., 1982) и силикагели (Chow et al., 1981). В настоящее время предпочитают использовать стекло с контролируемым размером пор, имеющее алкиламинную группировку с длинной алифатической цепью (Efimov et al., 1982). Соответствующий нуклеотид связывают со стеклом-носителем через сукцинильный спейсер в соответствии со схемой, показанной на рис. 5-1. Непрореагировшие аминогруппы носителя блокируют уксусным ангидридом.
Для оценки степени пришивки к носителю аликвоту «нагруженного» носителя обрабатывают кислотой. Это приводит к отщеплению диметокситритилкатиона, имеющего оранжевую окраску, что позволяет определить его концентрацию спектрофотометрически (при 495 нм). В среднем на 100 мг носителя приходится 1—3 мкмоль связанного олигонуклеотида.
Синтез на полимерных носителях
Олигонуклеотиды на полимерных носителях синтезируют в основном в направлении 3'—>-5'. З'-Концевой нуклеозид синтезируемой нуклеотидной цепи присоединяют к полимерному но-
90 Глава 5
Осн °сн
^сч ДМ АП ДМТо-^°'
дмт о-|^°^1 + f ДМТ о-^° ^ т ------НКП
I:
ОН *0 о-с-сн2-сн2-ссон
о
Осн — основание
ДМТ — диметокситритил
ДЦК — дициклогексилкарбодиимид
ДМАП — диметиламинопиридин
НКП —стеклянный носитель с порами контролируемого размера
1) ДЦК
, 2) ас2о
Осн
ДМТо-и^0>\|
o-c-ch^-ch^-c-nhw-v НКП II - * П
О О
Рис. 5-1.
сителю, как об этом упоминалось выше. Затем наращивают олигонуклеотид путем поэтапного добавления соответствующих блоков.
