Иммунологические методы исследований - Лефковитса И.
ISBN 5-03-0011-70-6
Скачать (прямая ссылка):
438 Глава 23
5. Культуральная система
для изучения миграции клеток
Разработана система (рис. 23-5) для изучения in vitro миграции ЛКП (лимфоидных клеток-предшественников) из гемопоэтической ткани донора в тимус реципиента (Jotereau et al.,
1980). В ней используют культуральную среду RPMI 1640, содержащую 10% СПК. В культуральную чашку Петри помещают металлическую сетку. Лежащие на сетке фильтры Nuclepo-ге или Millipore (диаметр пор 0,2—0,8 мкм) служат подложкой для гемопоэтической ткани донора. Непосредственно на гемо-поэтическую ткань накладывают фильтр Nuclepore с порами
кань-мишень-
Г ем on о этическая ткань
Фипьтр (размер гор 3-5 мкм)
Фильтр (размер пор 0(2-0г8 мкм> Металлическая сетка
Рис. 23-5. Культуральная «трансфильтровая» система, позволяющая лимфоидным клеткам-предшественникам мигрировать из гемопоэтической ткани донора в ткань-мишень (тимус).
такого размера, через которые могут пройти клетки (3—5 мкм), и на этот фильтр помещают зачаток тимуса. Миграцию клеток через фильтр можно обнаружить как методом иммунофлуоресценции (Jotereau et al., 1980), так и по морфологическим отличиям ядер в системе курица — перепел (Le Douarin et al., 1982).
Jl. Химеры зародыш — желточный мешок
и рекомбинанты бластодерм
В развивающейся бластодерме птиц существуют две зоны: центральная (area pellucida), дающая начало зародышу, амниону и аллантоису, и периферическая (area ораса), из которой образуется желточный мешок. Пересадка центральной части бластодермы на area ораса другой бластодермы, из которой предварительно была удалена area pellucida, приводит к образованию химер, содержащих зародыш от одного животного, а желточный мешок — от другого. Эти химеры получают до васкуляризации зародыша на 2-е сутки инкубации, что соответствует 8—12-й стадии развития (Hamburger, Hamilton, 1951). Методика пересадки впервые была описана Мартином (Martin, 1972). Через отверстие, просверленное над воздушным мешком, вскрывают вителлиновую оболочку, удаляют центральную часть бластодермы и заменяют ее area pellucida от другого зародыша того же возраста (приблизительно то же
Зародыши птиц в иммунологии
439
число сомитов), которая была предварительно вырезана из бластодермы на границе с центральной зоной. Затем чужеродный зародыш и желточный мешок объединяют, обрезая края бластодерм ножницами для иридэктомии и нанося каплю яичного белка на разрез. Сходным образом можно получать рекомбинанты различных частей бластодермы. Для получения рекомбинантов бластодермы вдоль передне-задней оси зародыша соответствующие части центральной зоны взаимозаменя-ют in ovo. Оба эти метода были использованы для изучение ранней эмбриональной дифференцировки гемопоэтических и лимфоидных стволовых клеток на химерах перепел — курица и курица — курица (Lassila et al., 1978; Martin et al., 1980).
М. Облучение и восстановление костного мозга
При работе с птицами для изучения дифференцировки и функционального потенциала клеток костного мозга на различных стадиях эмбрионального развития применяют метод, в котором используется химеризм в сочетании с маркировкой клеточных популяций половыми хромосомами (Moore, Owen, 1965; Weber,Mausner, 1977). Благодаря созданию новых методик культивирования костного мозга in vitro (гл. 22) и появлению моноклональных антител к клеткам различных линий дифференцировки (табл. 23-2) становится возможным более детально, чем ранее, изучать процесс гемопоэза, комбинируя исследования гемопоэтических клеток химер in vivo и in vitro. Для получения химер сначала гистосовместимые зародыши-реципиенты облучают, чтобы облегчить приживаемость и размножение инъецируемой им популяции клеток донора. Костный мозг как функционирующая структура впервые может быть идентифицирован в костях конечностей куриных зародышей на 14—15-е сутки инкубации. Это самый ранний срок, когда можно получить требуемые для трансплантации клетки донора, а реципиент способен обеспечить приживление донорских клеток с последующим развитием химеризма. Тимус и костный мозг реципиентов обычно наиболее подвержены колонизации клеткам донора, что приводит к высокому уровню химеризма по Т-клет-кам. Наблюдаются также заселение фабрициевой сумки и В-клеточный химеризм, который, однако, более вариабелен и обычно не полон (Weber, Mausner, 1977; Weber, Foglia, 1980).
1. Облучение зародышей
Для облучения зародышей-реципиентов предпочтительно использовать гамма-излучение, применяя в качестве источника 137Cs (Weber, Mausner, 1977). Гамма-излучение 137Cs- имеет
440 Глава 23
более узкий энергетический спектр и, как правило, обладает более высокой энергией, чем рентгеновское излучение из обычно используемых источников; поэтому оно вызывает меньший поверхностный эффект и более равномерно проникает в мишень. На 14-е сутки инкубации зародыши выдерживают общую однократную дозу гамма-излучения 750 Р, тогда как после дозы рентгеновского облучения >650 Р они не выживают. Гибель зародышей обычно наступает через 6 ч; она вызвана в основном диффузным поражением сосудов и кровоизлияниями в ткани, включая и хориоаллантоисную мембрану. Совершенно очевидно, что при облучении рентгеновскими лучами 14-суточные зародыши более чувствительны к данной дозе радиации (60— 70%-ная смертность при 650 Р), чем 15-суточные, смерть которых от той же дозы существенно ниже (10—15%). Эти наблюдения были сделаны при использовании облучателя Phillips RT 305 при 300 кВ, 10 мА, общем эквиваленте фильтрации 2,7 мм Си, скорости облучения 41 Р/мин и расстоянии 25 см. Для дозиметрии использовали микроионизационную камеру PTW (Р23312). Следует учитывать, что зародыши различных инбредных линий проявляют различную чувствительность к радиации (этот параметр нужно определять предварительно в специальных экспериментах).
