Иммунологические методы исследований - Лефковитса И.
ISBN 5-03-0011-70-6
Скачать (прямая ссылка):
Для прямого приготовления хромосомных препаратов из клеток тимуса или фабрициевой сумки необходима специальная модификация этой методики. Суть модификации состоит в двух основных изменениях. Первоначально полученный клеточный осадок (после 3—4 ч инкубации с колхицином) суспендируют в 0,5 мл ЗФР (Gibco 310-4080) (без сыворотки). Гипотонический раствор используют так же, как уже описано, но перед самым центрифугированием к клеткам в гипотоническом растворе добавляют 10 капель фиксатора и осторожно встряхивают пробирку. Центрифугирование и все остальные этапы проводят точно так, как было описано выше. Указанные прие-
Получение лимфоидных химер птиц
419
Таблица 22-2. Пролиферативный ответ клеток донора и хозяина на Кон-А и на антикуриный иммуноглобулин в культурах лимфоцитов периферической крови Т/В-клеточных химер‘>
Стимулятор Процентное (МИ)2) Число мито 1 Числс* мито TJ-
содержание зов в клетках и зов в клет X
митозов в донора на ках хозяина 1
клетках до 104 клеток3) на Ю4 клеток и
нора
Кон-А 9 67 60,3 3,6 609,7 596,4
Контроль 81 7 56,7 13,3 ---
Кр-анти-KIg 89 8 71,2 63,2 8,8 <1
Контроль 40 2 8,0 -- 12,0
(ИСК)
^ Клетки для культур получали через 9 мес после создания хнмер. Среда и условия культивирования описаны в тексте.
2)
Митотический индекс (МИ)—число митозов/103 клеток — подсчитывали на основании числа митозов на 2000 ядерных клеток.
Число митозов в клетках донора (хозяина) на 104 клеток в культуре вычисляли умножением процентного содержания митозов в клетках донора (хозяина) на МИ и на 10.
С—К —чистый ответ клеток донора (хозяина) на стимулятор; эту величину вычисляют, вычитая значения, полученные в контрольной культуре (К), нз значения, зарегистрированного в стимулированной (С) культуре. Полученные данные показывают, что в исследованных химерах клетки, отвечающие на кон-А, принадлежат реципиенту (Т-клетки), в то время как клетки, отвечающие на Кр-антн-KIg, являются донорскими (В-клеткн). Следовательно, эти химеры служат источником Т- и В-клеток с хромосомными маркерами.
мы позволяют избежать агрегации клеток фабрициевой сумки или тимуса. В противном случае получают препараты, не пригодные для анализа.
Г. Использование моноклональных антител
Мышиные моноклональные антитела (L-22) специфически реагируют с В-клетками, несущими аллоантиген Н.В21Ви-1а (Pink, Rijnbeek, 1983). Следовательно, клетки химер, реагирующие с L-22-антителами, должны быть В-лимфоцитами донорского происхождения. Для выявления L-22-положительных клеток лимфоциты, полученные непосредственно из крови, селезенки, тимуса, фабрициевой сумки, костного мозга или других тканей, а также культивируемые клетки суспендируют при концентрации 20-10® клеток/мл в охлажденном во льду ЗФР-Х (содержащем 1% БСА и 0,02% азида натрия). В круглодонные лунки 96-луночных панелей для культивирования (Costar 3799) вносят 50 мкл (1,0-10® клеток), заливают в лунки ЗФР-Х и центрифугируют панели при 200 g 1 мин. Надосадочную жидкость удаляют однократным встряхиванием перевернутой панели. Осадок клеток разрыхляют встряхиванием на вортексе и однократно промывают. К диспергированным клеткам добавляют моноклональные антитела (50 мкл) и смесь инкубируют
27*
420 Глава 22
20 мин во льду. Затем лунки заполняют ЗФР-Х и дважды промывают клетки. После второй промывки в лунки вносят по 50 мкл меченных ФИТЦ козьих антител к иммуноглобулинам мыши (разбавленных 1:2 в ЗФР-Х). После 20 мин инкубации во льду клетки, как и ранее, дважды промывают и окончательно ресуспендируют в ~25 мкл ЗФР-Х. Каплю хорошо перемешанной суспензии наносят на предметное стекло, накрывают покровным стеклом, которое герметизируют лаком для ногтей, и исследуют с помощью люминесцентного микроскопа. Суспензию, в которой ожидается большое содержание погибших клеток, можно очистить от них центрифугированием в градиенте Ficoll-Paque при 400 g в течение 20 мин при комнатной температуре. Для небольших объемов клеточной суспензии в качестве недорогой и удобной центрифужной пробирки можно использовать пастеровские пипетки, запаянные на сужающемся участке. Полученные из градиента Ficoll-Paque жизнеспособные клетки затем обрабатывают так, как описано выше.
V. ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ ЗАМЕЧАНИЯ
Успех создания Т/В-клеточных химер, полностью лишенных В-клеточной популяции хозяина и не «загрязненных» Т-клет-ками донора, зависит главным образом от эффективности уничтожения популяции В-клеток хозяина, которая определяется правильной дозировкой циклофосфамида, вводимого по жесткому расписанию. Не менее важно, чтобы адекватное число жизнеспособных клеток фабрициевой сумки донора было трансплантировано реципиенту без значительной примеси периферической крови, которая является потенциальным источником Т-клеток. Лучше всего получать клетки фабрициевой сумки от доноров-цыплят 1—3-суточного возраста или даже от зародышей поздних стадий (20—21-е сутки). Клетки фабрициевой сумки, взятые в этот период, гораздо эффективнее заселяют строму соответствующего органа реципиента, и среди таких клеток не содержится Т-лимфоцитов или содержится лишь небольшое их число. Ценность описанных химер состоит в том, что они являются иммунологически полноценными животными, у которых В- и Т-клетки имеют хромосомные маркеры. Следовательно, химеры являются гораздо лучшими источниками В- и Т-лимфоцитов для функциональных исследований, чем те животные, у которых популяции В- или Т-клеток избирательно истощены общепринятыми химическими или хирургическими методами. В последнем случае всегда возникает вопрос, в какой степени отсутствие клеток данной линии дифференцировки влияет на функционирование оставшейся популяции лимфоцитов. Т/В-кле-точные химеры птиц оказались чрезвычайно полезными при
