Иммунологические методы исследований - Лефковитса И.
ISBN 5-03-0011-70-6
Скачать (прямая ссылка):
Yanagi Y., Yoshikai Y., Leggett K., Clark S. P., Aleksander I., Mak T. (1984).
Nature (London), 308, 145—149.
Yamamoto F., Furusawa M„ Takamatsu K„ Miura N., Chida T. (1981). Exp. Cell Res., 135, 341—345.
Глава 3
Клонирование кДНК с помощью векторов, обеспечивающих экспрессию в клетках-хозяевах
М. Хирама
I. ВВЕДЕНИЕ
Разработка технологии получения рекомбинантных ДНК необычайно расширила наше понимание проблемы структуры и функции генов. В большинстве успешных методов клонирования генов важное место занимает клонирование кДНК, поскольку: 1) кДНК представляет собой инструмент для последующего скрининга геномных библиотек с целью выделения гена, которому она соответствует, и 2) кДНК соответствует структуре зрелой мРНК, в то время как данный ген содержит в своей структуре интроны (по крайней мере в большинстве случаев). Кроме того, поскольку кДНК представляет собой непосредственный продукт зрелой мРНК, можно с помощью кДНК синтезировать полипептиды, кодируемые соответствующей мРНК-Это открывает возможность получения редких белков с помощью биотехнологии для их последующего анализа и (или) практического использования.
В настоящее время довольно трудно найти для клонирования новую кДНК, поскольку большинство кДНК, которые легко клонируются, уже проклонированы. Имеющие биологический интерес мРНК, которые не были проклонированы, содержатся в очень малых количествах, и поэтому данные об аминокислот-ных последовательностях и других свойствах белков, которые они кодируют, довольно скудны. В связи с этим единственным способом для выделения кДНК-клона, соответствующего данной мРНК, является биологическое определение соответствующего белка или его детектирование с помощью антител. Оба эти метода скрининга могут использоваться в рамках процедуры, включающей следующие этапы: 1) гибридизацию, 2) выделение мРНК, соответствующей кДНК, и 3) микроинъекцию выделенной мРНК в ооциты шпорцевой лягушки. Более удобным примером, однако, является экспрессия клонированных кДНК в клетках-хозяевах с образованием активных в биологическом или антигенном отношении продуктов. При этом можно получать большие количества биологически активных белков, не прибегая к
Клонирование кДНК
49
микроинъекциям мРНК в ооциты. К сожалению, пока не существует общей процедуры, которая может быть использована для vконструирования «экспрессируемой библиотеки кДНК». Трудности этого подхода, обусловленные различными механизмами транскрипции и трансляции в прокариотических и эукариотических системах, коротко резюмированы ниже.
В настоящей главе описан только один, наиболее простой подход конструирования библиотеки кДНК, экспрессирующейся в клетках-хозяевах.
II. ОБЩИЕ ПОДХОДЫ И СВЯЗАННЫЕ С НИМИ
ТРУДНОСТИ
Существует два различных класса хозяев, используемых при клонировании кДНК: прокариотические клетки (например,
Е. coli) и эукариотические клетки (в основном это фибробласты). В большинстве случаев экспрессию кДНК налаживают с использованием кДНК, которая была уже проклонирована с помощью какого-либо другого метода, не приводящего к экспрессии. В эукариотической системе скрининг библиотеки кДНК на основе экспрессии пока представляется мало реальной задачей (Okayama, Berg, 1983). К тому же еще недостаточно изучены механизмы активации генов и функционирования промоторов, а контрольные механизмы, вляющие на биосинтез белка, могут оказаться специфичными для каждого вида мРНК.
Вместе с тем в качестве хозяина для клонирования кДНК широко использовали бактерию Е. coli. Общие механизмы активации генов и синтеза белка в этих клетках известны очень хорошо. Кроме того, были затрачены большие усилия для получения у них экспрессии кДНК. В результате в настоящее время мы располагаем весьма фундаментальными знаниями, касающимися экспрессии кДНК в Е. coli. Тем не менее изучение этого процесса у Е. coli — задача не из легких, и это обусловлено следующими трудностями.
1. Пулы аминокислот в Е. coli отличаются от пулов в эукариотических клетках, так что одна или несколько аминокислот, обильно представленных в пуле эукариот, могут быть в дефиците в аминокислотном пуле клеток кишечной палочки.
2. Вследствие неизвестных причин полипептиды эукариотического происхождения, синтезируемые в клетках Е. coli, как правило, неустойчивы и быстро деградируют.
3. Чтобы обеспечивалось эффективное функционирование, промотор, участок связывания с рибосомой и инициирующий кодон AUG должны находиться на оптимальном расстоянии друг от друга.
4—1278
50 Глава 3
I
/
4. Иногда плазмиды становятся нестабильными в результате экспрессии присутствующей в них кДНК.
Хотя могут существовать и другие трудности, четыре, Перечисленные выше, являются наиболее важными. При конструировании библиотеки кДНК, которая подвергается экспрессии в клетках Е. coli, для клонирования кДНК необходимо использовать экспрессирующий вектор (обычно плазмиду). Экспрессирующий вектор должен отвечать всем требованиям, необходимым для экспрессии присутствующей в нем кДНК. а именно: в нем должны содержаться промотор, последовательность Шай-на — Дельгарно, или участок связывания рибосомы, инициирующий кодон AUG, а также сигнал терминации транскрипции.
