Иммунологические методы исследований - Лефковитса И.
ISBN 5-03-0011-70-6
Скачать (прямая ссылка):
А. Препараты лимфоцитов крови,
селезенки и тимуса
Лейкоциты периферической крови (ЛПК), которые лишь в ничтожной степени загрязнены ядерными тромбоцитами, эритроцитами и гранулоцитами, лучше всего выделять с помощью методики низкоскоростного центрифугирования (Hudson, Roitt, 1973) с незначительными модификациями (Vainio,
Получение лимфоидных химер птиц
415»
Ratcliffe, 1984). Кровь берут в гепарин без консервантов (Liquemin, Roche, Швейцария, 10 ед. на 1 мл крови) и оставляют на 1 ч при комнатной температуре. Шприц с кровью несколько раз переворачивают вверх-вниз, затем кровь разбавляют в пластиковых пробирках (Falcon 2051) теплым (40 °С) солевым раствором Эрла (1 часть крови+2,2 части раствора Эрла) и тщательно перемешанные образцы центрифугируют при 50 g 20 мин при комнатной температуре. Клетки богатой лейкоцитами надосадочной жидкости используют в качестве источника лимфоцитов. Обычно выход составляет 4,5—6 -10® ЛПК на 1 мл крови. Большая часть этих клеток является мононуклеарами. Следует заметить, что для клеток крови кур в отличие от других видов не подходит метод фракционирования в градиенте плотности Ficoll-Paque (Pharmacia, Швеция, 1,077 г/л), поскольку полученные с его помощью препараты содержат 60—80% ядерных тромбоцитов. Последние часто по ошибке принимают за лимфоциты. В присутствии умеренного числа птичьих тромбоцитов пролиферация лимфоцитов в большинстве культур, стимулированных митогеном, подавляется или значительно задерживается.
При получении препаратов клеток селезенки или тимуса соответствующие органы забирают от обескровленных животных. После удаления капсулы органа клетки получают тем же способом, который был описан выше для клеток фабрициевой сумки.
Б. Усовершенствованные условия культивирования
в отсутствие сыворотки
Лимфоциты птиц из крови, селезенки или тимуса можно успешно культивировать в бессывороточной среде МСИ, содержащей заменимые аминокислоты и глутамин (MEM, Gibco 410-1500), в которую добавляют инсулин (1 ед./мл) (Weber, 1970, 1975). Для этих целей используют также другие среды, такие как RPMI 1640 (Kirchner et al., 1972), модифицированная среда Мак-Коя 5А (Vainio, Ratcliffe, 1984) или среда Дульбекко, модифицированная Исковом (Schou, 1980; Traill et al., 1984), но к ним, как правило, добавляют сыворотку. Как показывают многочисленные эксперименты, при соблюдении большинства условий, упомянутых выше, Т-клеточные митогены, особенно Кон-А или ФГА, в оптимальных концентрациях вызывают хороший пролиферативный ответ. В бессывороточной среде может быть успешно инициирована также реакция в смешанной культуре лимфоцитов (Weber, 1970; Schou, 1980). Вместе с тем периферические В-клетки или клетки фабрициевой сумки более
416 Глава 22
капризны и условия для их культивирования менее изучены. Для цыплят единственным достоверно известным селективным стимулятором размножения В-клеток является антикуриный иммуноглобулин (Ivanyi et al., 1969; Weber, 1973, 1975).
Для культивирования лимфоцитов птиц, особенно периферических В-клеток, в настоящее время оптимальными являются следующие условия. Основную среду готовят, растворяя 9,6 г сухой МСИ, содержащей заменимые аминокислоты и глутамин (MEM, Gibco, 410—1500), в 800 мл воды, трижды перегнанной в стеклянном дистилляторе, в которую добавляют ИаНСОз (2,2 г). Осмоляльность полученного раствора находится в интервале 0,350—0,365, т. е. раствор немного гипертоничен. Осмоляльность нормальной сыворотки или плазмы крови цыплят равна 0,325—0,330. В среду добавляют: инсулин (Eli Lilly,
U-100 Isletin insulin в концентрации 0,75—1 ед./мл или Gibco €80-3007 в концентрации 5 мкг/мл), обезжиренный БСА в концентрации 0,5 мг/мл (Boehringer Mannheim 652 237); кон-альбумин; птичий трансферрин в концентрации 30 мкг/мл (Sigma Ф С-0880) или трансферрин фирмы Gibco (Gibco €80-3008) в концентрации 5 мкг/мл; липиды, приготовленные по методу Искова и Мелчера (Iscove, Melchers, 1978) и оттитрованные для выявления оптимальной для размножения клеток концентрации (обычно 0,25—0,50 мл/100 мл); пируват натрия (Gibco 043-1360) в концентрации 1 мг/100 мл; витамин В12 (Sigma V2876) и биотин (Sigma В4501) в концентрации
1,3-10-5 мг/мл каждый (приготовить исходный раствор витамин В12 — биотин, растворив по 0,25 мг/мл каждого компонента в 1 мМ НС1, аликвоты хранить при —20 °С); смесь микроэлементов (Gibco 680-3014) в концентрации 1 мг/100 мл. Добавление 0,01 мкг/мл а-токоферола (Gibco 680-3002) и 0,05 мкг/мл аскорбиновой кислоты (Gibco 680-3001) несущественно улучшает условия культивирования (два последних вещества нестабильны). В среду добавляют, кроме того, 2-МЭ (5-10-5 М), 100 ед./мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина. Бутыли со средой хранят в потоке стерильного воздуха с 5% С02, чтобы поддержать pH между 7,3 и 7,5. В табл. 22-1 сравниваются результаты использования полной среды со всеми добавками (Л) и той же самой среды, но содержащей только инсулин и антибиотики (Б), при культивировании клеток селезенки птиц в присутствии различных митогенов.
