Иммунологические методы исследований - Лефковитса И.
ISBN 5-03-0011-70-6
Скачать (прямая ссылка):
Методы сортировки клеток в иммунологии
349
Б. Получение количественных данных
Получение количественных результатов означает определение доли клеток, приходящейся на данную субпопуляцию, и средней интенсивности сигнала для этой субпопуляции. Первый процесс называют интегрированием, так как он предполагает суммирование, или интегрирование, а второй — определение средней интенсивности сигнала для субпопуляций — называют определением интенсивности.
1. Выбор интервала значений для анализа
Первым шагом в получении количественных результатов является выбор интервала интенсивностей, который определяет интересующую исследователя популяцию. Если ставится задача только отличить позитивные клетки от негативных (рис. 20-7,Л), то достаточно выбрать пороговое значение параметра (оно показано на рис. 20-7, Л стрелкой под осью х). Клетки, дающие сигнал флуоресценции с интенсивностью выше этого значения, считают позитивными, а те, для которых сигнал имеет интенсивность ниже этого значения, считают негативными. На рис. 20-7, Б показана другая ситуация. Здесь видны три пика, один из которых соответствует негативным, а два других— позитивным клеткам. Стрелки под осью х указывают интервал, соответствующий клеткам позитивной субпопуляции с низкой интенсивностью флуоресценции. Выбор интервала, определяющего субпопуляцию, зависит от формы кривых, однако в какой-то степени он произволен. Таким образом, по-разному определяя субпопуляцию, можно изменять результаты (например, значения частоты встречаемости), полученные для этой субпопуляции. Одним из способов проверки достоверности выбранного интервала является смещение пороговых значений на
5—10% (в приведенных примерах — это 50—100 каналов) с последующей оценкой влияния новых значений на результаты. Если результаты остались почти такими же, то можно считать что интервал, определяющий субпопуляцию, выбран правильно и что анализ достоверен.
2. Интегрирование
После выбора интервала для анализа можно рассчитать относительную долю клеток, попадающих в этот интервал, что соответствует относительной частоте встречаемости клеток данной субпопуляции в исследованном пуле клеток. Эту долю можно подсчитать, суммируя число клеток для каждого уровня интенсивности в пределах выбранного интервала, а затем деля
350 Глава 20
Таблица 20-1. Результаты интегрирования данных, представленных яа рис. 20-7
Рисунок Интервал (номера Опытная проба, % Контрольная про
каналов) ба. %
20-7, А 301---Ю24 30,4 0,8
351---1024 29,3 0,5
401---1024 28,4 0,2
20-7, Б 251---600 35,5 0,6
601---1024 34,1 0,0
полученное значение на общее число проанализированных клеток данного образца. Суммирование на первом этапе расчета с точки зрения математики является приближением интегрирования. В табл. 20-1 приведены результаты интегрирования в различных интервалах для данных, представленных на рис. 20-7.
3. Определение интенсивности окрашивания
Во многих случаях возникает необходимость присвоения некоторого среднего значения интенсивности окрашивания субпопуляции клеток по регистрируемому параметру. Например, исследователя могут интересовать модуляции поверхностного клеточного маркера в ответ на действия различных стимулирующих факторов. Конечной целью таких опытов является получение информации об изменении интенсивности окрашивания позитивных клеток.
Чаще всего для описания значения интенсивности окрашивания субпопуляции используют следующие средние величины: 1) среднеарифметическое, 2) медиану, 3) моду и 4) среднегеометрическое. Среднеарифметическое является обычным средним значением. Его получают делением суммы значений на их общее количество. Медиана соответствует вертикальной линии, которая делит распределение частоты встречаемости на две части равной площади. Мода отвечает значению, которое встречается в распределении наибольшее число раз. Среднегеометрическое определяют, вычисляя антилогарифм среднеарифметического логарифмов значений. Когда данные получают с использованием логарифмического усилителя, антилогарифм средней интенсивности распределения и дает среднегеометрическое.
Когда все средние показатели имеют примерно одинаковое значение, можно выбрать для работы любой из них. Если же они различаются, то для выбора одного из них следует проанализировать плотность распределения частот встречаемости. На значение среднеарифметического влияют асимметрия распреде-
Методы сортировки клеток в иммунологии
351
Таблица 20-2. Статистическая обработка данных, представленных на рис. 20-7А>
Данные рисунка Интервал Среднее Медиана Мода
20-7, А:
Опытная проба 1---350 148(3,9) 154(4,1) 172(4,9)
351---1024 624(313) 638(356) 654(413)
Контрольная проба 1---1024 148(3,9) 156(4,2) 174(5,0)
20-7, Б:
