Иммунологические методы исследований - Лефковитса И.
ISBN 5-03-0011-70-6
Скачать (прямая ссылка):
Q
X ; *
б v
X
----
т-------1-------1-------г ---------1-------1------1-------Н
500 1000 500 1000
Номер канала
Рис. 20-5. Сравнение результатов, получаемых при различных значениях коэффициента усиления.
стояние, которое разделяет два значения на оси, соответствует разнице этих двух значений. На логарифмической шкале это расстояние соответствует отношению этих значений. На линейной шкале значения, малые по сравнению с размерами всей шкалы, располагаются близко друг к другу около оси у. Это справедливо, даже если они различаются на один или несколько порядков. Вместе с тем большие величины, различающиеся только в два раза, располагаются далеко друг от друга. В логарифмическом масштабе малые значения также откладываются левее больших, но расстояние между двумя значениями, различающимися в данное число раз, будет постоянным независимо от того, большие они или малые.
На рис. 20-5, А представлены результаты, полученные при использовании четырехразрядного логарифмического усилителя. По оси х отложены номера каналов, т. е. цифры, выдаваемые БПЦЗ. Один десятичный порядок усиления отвечает 250 каналам (1000 каналов на 4 порядка = 250 каналов на порядок), что отражено на шкале. Острый пик на левом конце шкалы отвечает сигналам, которые ушли бы в соответствии со
Методы сортировки клеток в иммунологии
345
своими амплитудами за пределы шкалы влево. Их искусственно вводят в графическое построение для того, чтобы в нем была отражена информация для всех проанализированных клеток.
Использование логарифмического усиления дает одинаковое разрешение для всех порядков. При применении линейного усиления с БПЦЗ, имеющим 1000 каналов, шкала захватывает три порядка амплитуд сигналов (1000= 103). Первому порядку соответствуют каналы от 1 до 10, второму от 10 до 100 и третьему от 100 до 1000. Для каждого порядка характерно свое разрешение, т. е. для первого порядка регистрируется только 10 возможных значений, для второго 90 и для третьего 900. При использовании трехразрядного логарифмического усилителя для каждого порядка разрешение одинаково, т. е. на каждый порядок приходится (1000 каналов на 3 порядка) 333 канала.
На основе вышеизложенного относительно данных, получаемых на сортере с логарифмическим усилителем, можно сделать следующие выводы: 1) данные, получаемые для ярко- и слабо-окрашенных клеток, имеют одинаковое разрешение и 2) в пределах одной шкалы умещается большее число порядков величин сигналов, чем в случае линейного усиления.
3. Выбор типа усиления
Решение об использовании того или иного типа усиления в значительной степени зависит от той информации, которую необходимо получить в ходе опыта, и от склонностей и вкусов экспериментатора. Если большая часть информации будет заключена в импульсах, отличающихся по амплитуде не более чем на порядок, то можно использовать линейный усилитель. Именно такой вариант мы имеем в случае окрашивания ДНК (рис. 20-6). Количество ДНК в клетках популяции может различаться примерно в два раза. При линейном усилении (рис. 20-6, А) это четко видно. Большинство зарегистрированных сигналов попадает в диапазон каналов от 300 до 800. Этот же образец был изучен при использовании накопления данных с усилением на четырехразрядном логарифмическом усилителе (рис. 20-6, Z>). В этом случае большинство сигналов попадает в каналы с номерами между 300 и 430. Логарифмическое усиление привело к уменьшению разрешения интересующего диапазона с 500 каналов до 130. Более того, логарифмическое усиление делает гораздо более трудной интерпретацию результатов с точки зрения сигналов, соответствующих клеткам на разных стадиях клеточного цикла (так как на логарифмической шкале трудно определить двукратное уменьшение сигнала).
Вместе с тем при окрашивании поверхностных антигенов лучше использовать логарифмическое усиление. Интенсивность
346 Глава 20
поверхностного окрашивания зачастую в 100 и более раз превышает фоновые значения. Содержание некоторых антигенов у индивидуальных клеток в популяции в значительной степени различается. При использовании линейного усиления для исследований таких антигенов экспериментатор должен выбирать шкалу для регистрации или наиболее интенсивно окрашенных клеток, или самых слабоокрашенных клеток, но не может регистрировать клетки обоих типов одновременно. Логарифмическое усиление с достаточно широким диапазоном шкалы дает
0,01- А - Б
Линейное Логарифмическое
X усиление усиление
1---
о
О
5
си ~
го
т
