Иммунологические методы исследований - Лефковитса И.
ISBN 5-03-0011-70-6
Скачать (прямая ссылка):
3. Сыворотка крови человека (СКЧ) группы АВ
Сыворотку крови человека группы АВ, полученную от здоровых доноров, инактивируют нагреванием (56 °С, 30 мин) и проверяют в культуре клеток селезенки, индуцированных к про-
Условия для получений линий пре-В-клеток
303
V-----------------------------------------
лиферации ЛПС и К^н-А. Мы обнаружили, что большинство партий СКЧ группы Ав имеет достаточно высокую активность при конечной концентрации от 0,5 до 2%. Более высокие концентрации иногда подавляют пролиферацию клеток селезенки, вызванную ЛПС, и их превращение в антителосекретирующие клетки.
4. Антибиотики
Используются следующие антибиотики: гентамицин
(50 мкг/мл), хлортетрациклингидрохлорид (100 мкг/мл), тило-зин (50 мкг/мл), линкомицин (50 мкг/мл).
5. Посуда для культивирования
Для культивирования используют: чашки для культуры ткани Limbro (Flow Laboratories, 1,7X1,6 см, номер по каталогу 76-033-05), микропанели с плоско- и круглодонными лунками (Nuclon Delta A/S Nunc, Дания), пластиковые флаконы для культуры ткани (50 мл, A/S Nunc).
6. Колонки с нейлоновой ватой
Нейлоновую вату кипятят в тридистилляте в течение 1 ч. Промытую вату заворачивают в марлю, отжимают избыток жидкости, раскладывают на подносе, покрытом фильтровальной бумагой, высушивают в термостате при 37 °С и хранят в закрытом контейнере. Ватой (0,6 г) заполняют пластиковые шприцы на 10 мл и стерилизуют их.
7. Культуральная среда А (КС-А)
Используют модифицированную Исковом среду Дульбекко (МСИДИ), в которую добавляют инактивированную нагреванием СПК (5—7%), гентамицин и 2-МЭ (5-10-5 М).
8. Культуральная среда Б (КС-Б)
Используют среду RPMI 1640, в которую добавляют СКЧ группы АВ (1—2%), гентамицин и L-глутамин (2 мМ).
9. ИЛ-3
В качестве источника ИЛ-3 используют клетки WEHI-3. Клетки WEHI-3, предоставленные д-ром Евой Северинсон (Ка-rolinska Institute, Stockholm, Швеция), первоначально были по-
304 Глава 18
/
/
лучены от д-ра Ноэля Варнера (Becton-Dickinson, СА). Клетки WEHI-3, предоставленные д-ром Норманом Исковом (Basel Institute for Immunology), первоначально были получены от д-ра Петера Ральфа (Sloan-Kettering Cancer Research Center, NY). Клетки WEHI-3 из обоих источников спонтанно секрети-ровали ИЛ-3 и не секретировали ИЛ-2, ИЛ-1 или гамма-интерферон (см. ниже). Клетки WEHI-3 культивировали в среде КС-A или в среде КС-Б.
III. НАДОСАДОЧНАЯ ЖИДКОСТЬ ИЗ КУЛЬТУР КЛЕТОК WEHI-3
Надосадочную жидкость из культур клеток WEHI-3 (WEHI-SUP) готовят следующим образом: 2-106 клеток, суспендированных в 1 мл КС-A или КС-Б, инкубируют во флаконах для культуры тканей (объем 250 мл) без стимуляции при 37 °С в течение 4 сут. Надосадочную жидкость собирают и фильтруют через фильтры с размером пор 0,2 мкм. В партиях WEHI-SUP (по 500 мл) проверяют активность ИЛ-3, ИЛ-2 и ИЛ-1, как описано ниже. Партии, содержащие активный ИЛ-3, разливают на аликвоты и хранят до использования при —20 °С.
IV. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ ИЛ-3
Концентрации WEHI-SUP, оптимальные для роста ИЛ-З-за-висимых В-клеточных предшественников, определяют на соответствующих тест-линиях предшественников В-клеток. Обычно мы используем для этих целей клетки линии ЕаЗ, которые размножаются в присутствии рекомбинантного мышиного ИЛ-3, а также ИЛ-3, очищенного до гомогенного состояния, и имеют на своей мембране рецепторы для этого интерлейкина (Palacios et al., 1984; Palacios, Garland, 1984).
Клетки ЕаЗ в логарифмической фазе роста четырежды промывают СР и ресуспендируют в КС-Б или среде RPMI 1640 без сыворотки, но в присутствии L-глутамина и гентамнцина. В каждую лунку (плоско- или круглодонную) микропанелп вносят по 100 мкл КС-Б или бессывороточной среды (по желанию). Готовят шесть двукратных последовательных разведений тестируемой WEH1-SUP и добавляют 104 клеток ЕаЗ в конечном объеме 200 мкл на лунку. Пролиферацию клеток оценивают по включению 3Н-тимидина (9,25 GBq на лунку) в последние 4—6 ч 24-часовой инкубации при 37 °С.
При желании WEHI-SUP тестируют также на активность ИЛ-2 и ИЛ-1. Активность ИЛ-2 определяют (Gillis et al., 1978), используя в качестве мишеней ИЛ-2-зависимую линию Т-клеток. Активность ИЛ-1 тестируют или на тимоцитах (Gery et al.,
Условия для получений линий пре-В-клеток
305
\
Таблица 18-1. Титрование,WEHI-SUP для определения активности ИЛ-3, ИЛ-2 и ИЛ-1
Источник иадоса Активность ИЛ-3, имп/мии')
1 : 4 1:8 1 :16 I : 32 1 : 64 1: 128
Среда 320 312 315 310 312 305
WEHI-SUP 23 602 22336 17 224 9320 4618 835
U-937 SUP 318 304 310 301 321 307
EL-4 SUP 412 310 302 311 304 301
Активность ИЛ-2, имп/мин1»
Среда 218 210 217 204 210 215
WEHI-SUP 212 205 220 213 201 212
