Иммунологические методы исследований - Лефковитса И.
ISBN 5-03-0011-70-6
Скачать (прямая ссылка):
Leibo S. P., Mazur P. (1978). In: Methods in Mammalian Reproduction (J. L. Daniel, ed.), p. 151, Academic Press, New York.
Meuer S. C., Hussey R. E., Cantrell D. A., Hodgdon J. C., Schoossman S. F., Smith K. A., Reinherz E. I. (1984). Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81, 1509.
Morrow J. (1982). In: Technicals in Somatic Cell Genetics (J. W. Shay, ed.), pp. 1—9, Plenum, New York.
Nabholz М., Cianfriglia М., Acuto 0., Conzelmann Л., Haas W., v. Boehmer H„ MacDonald H. R., Pohlit H., Johnson J. P. (1980). Nature (London), 287, 437.
Nabholz М., Cianfriglia М., Oreste A., Conzelmann A., Weiss A., Haas W., v. Boehmer H. (1982). In: Research Monographs in Immunology (G. J. Ham-merling, U. Hammerling, J. F. Kearney, eds.), vol. 3, Elsevier, Amsterdam.
Pohlit H., Haas W., von Boehmer H. (1979). Eur. J. Immunol., 9, 681.
Ruddle N. H. ("1982). Lymphokines, 1, 49—76.
Schimmelpfeng L., Langenberg U., Peters J. H. (1980). Nature (London), 285, 661.
Schreier М. H., Tees R. (1980). Int. Arch. Allergy Appl. Immun., 61, 227.
Schreier М. H., Iscove N. N., Tees R., Aarden von Boehmer H. (1980). Immu-
nol. Rev., 51, 315.
Silva A., MacDonald H. R., Conzleman A., Corthesy P., Nabholz M. (1983). Immunol. Rev., 76, 105.
Taylor I. W., Milthorpe В. K. (1980). J. Histochem., 28, 1224.
Глава 18
Условия для получения in vitro мышиных линий предшественников В-клеток, зависимых от интерлейкина-3
Р. Паласиоз
I. ВВЕДЕНИЕ
Дифференцировка В-лимфоцитов представляет большие возможности для биологического моделирования и изучения многих сторон клеточного роста и дифференцировки. Исследование этих процессов на клеточном и молекулярном уровне тормозится трудностями, которые возникают при получении гомогенных популяций нормальных клеток на разных стадиях дифференцировки В-клеток. Мы обнаружили, что интерлейкин-3 (ИЛ-3) — гликопротеин с мол. массой 24 кДа (Ihle et al., 1982а; Yokota et al., 1984)—стимулирует рост свежевыделенных из эмбриональной печени предшественников В-клеток и способствует длительному культивированию предшественников В-клеток из костного мозга и селезенки различных линий мышей (Palacios et al., 1984а). ИЛ-3 способствует размножению клеток-предшествен-ников, представляющих три стадии В-клеточной дифференцировки.
1. Стволовые клетки В-лимфоцитов имеют поверхностные антигены, свойственные В-клеточной линии дифференцировки (В-220), но не экспрессируют антигены Т-клеток (Thy-1, Lyt-1, Lyt-2), не имеют миелоидных маркеров (Jlld, Мас-1) и не экспонируют на своей поверхности IgM- или 1а-антигены. Гены как тяжелых, так и легких цепей иммуноглобулинов в этих клетках еще не перестроены. Они способны дифференцироваться in vivo до стадии, на которой in vitro они могут быть индуцированы к созреванию вплоть до антителосинтезирующих клеток. Примером клеток такого типа могут служить клеточные линии Ва/Cl, LBAgA2, СВ/Вш7 и BC/Bmll, описанные ранее (Palacios et al., 1985).
2. Ранние пре-В-клетки имеют фенотип, идентичный фенотипу стволовых В-клеток, но содержат перестроенный ген тяжелых [.i-цепей. Гены легких цепей у этих клеток все еще находятся в исходном состоянии. Ранние пре-В-клетки способны дифференцироваться in vivo до стадии, на которой уже и in vitro могут быть стимулированы к превращению в антителосинтезирую-
302 Глава 18
щие клетки. Примером клеток такого типа может служить описанная ранее линия SJ/B (Palacios et al., 1984).
3. Поздние пре-В-клетки отличаются от ранних пре-В-кле-ток тем, что содержат в перестроенном состоянии как гены тяжелых ц-цепей, так и гены легких и-цепей. Поздние пре-В-клетки после соответствующей стимуляции способны непосредственно in vitro к дифференцировке в Ig-секретирующие плазматические клетки.
Мы не обнаружили никаких данных, указывающих на то, что ИЛ-3 стимулирует размножение зрелых (несущих поверхностный иммуноглобулин) В-лимфоцитов (Palacios et al., 1984). Кратковременную пролиферацию активированных В-клеток могут вызывать факторы, отличные от ИЛ-3 (называемые факторами роста В-клеток) (Leanderson et al., 1982; Lerndhard et al., 1982; Howard et al., 1982).
Цель настоящей главы состоит в детальном описании методики, позволяющей воспроизводимо получать долговременные культуры ИЛ-З-зависимых предшественников В-лимфоцитов из костного мозга и селезенки мышей.
II. МАТЕРИАЛЫ
1. Животные
Мы смогли получить линии предшественников В-клеток от
4—9-недельных самцов и самок мышей C57BL/6, BALB/c, SJL, CBA/J, B10T.6R, C3H/Hej, (NZB/W)F,, MRL/MP-lpr-lpr, CBA/N и BALBc пи/пи, а также от 15—20-недельных мышей SJL и MRL/MP-lpr-lpr. Для получения необходимых навыков мы рекомендуем в начале работы использовать клетки мышей BALB/cnufпи и MRL/MP-lpr-lpr (костный мозг и селезенка). Линии предшественников В-клеток проще получить от мышей именно этих линий, вероятно, потому, что их ткани содержат относительно большое число ИЛ-З-зависимых В-клеточных предшественников.
2. Сыворотка плода коров (СПК)
Для опытов подходит любая партия СПК, которая обеспечивает хороший пролиферативный ответ культур селезенки (105 клеток на лунку микропанели) на бактериальный ЛПС и Кон-А.
