Иммунологические методы исследований - Лефковитса И.
ISBN 5-03-0011-70-6
Скачать (прямая ссылка):
Цитолитические Т-клеточные клоны и гибридомы
291
Ж- Выявление заражения микоплазмой и ее ликвидация
Известно, что при заражении микоплазмой происходят изменения свойств клеточных линий (Fogh, 1973). К ним относятся изменения кариотипа, эффективности клонирования и способности клеток к гибридизации (Morrow, 1982). Мы регулярно тестировали наши линии ЦТЛ на заражение микоплазмой и успешно ликвидировали ее из нескольких инфицированных линий ЦТЛ.
1. Проба на заражение микоплазмой
Модификация известного метода (Fogh, Fogh, 1964) была введена в практику нашей лаборатории д-ром Стокером. В лунки панели Costar 3524 вносили по 4-104 клеток HeLa в 1 мл среды и 1 мл среды, кондиционированной клетками тестируемых линий, или 1 мл среды, подлежащей проверке. Через 2—3 дня инкубации клетки HeLa фиксировали. После отсасывания среды в лунки наливали 750 мкл 0,6%-ного цитрата. Для того чтобы вызвать гипотоническое набухание, по каплям добавляли 250 мкл дистиллированной воды и через 5 мин 1 мл свежеприготовленного фиксатора Карнуа (25% ледяной уксусной кислоты и 75% этанола). Затем жидкость из лунок отсасывали и добавляли 500 мкл свежего фиксатора. Через 10 мин удаляли фиксатор и пробы полностью высушивали. Для окрашивания ДНК добавляли двусолянокислый хинакрин (0,01%-ный раствор в дистиллированной воде). Через 10 мин лунки высушивали, вырезали донышки, помещали их на предметное стекло и просматривали с помощью флуоресцентного микроскопа при стократном увеличении. Этим способом легко обнаружить микоплазму, которая ассоциирована главным образом с поверхностью клеток HeLa (Fogh, 1973).
2. Ликвидация микоплазмы
Некоторые наши цитол итические Т-клеточные линии оказались инфицированными микоплазмой, источник которой остался неизвестным. Мы не определяли видовой принадлежности этих микроорганизмов. Инфекция не повлияла заметно на размножение клеток и их литическую активность. Мы успешно ликвидировали эту инфекцию, следуя методике, описанной ранее (Schimmelpfeng et al., 1980). Клетки клонировали, как описано выше (разд. III, Д, 3), в CS-среде, содержащей антибиотики линкомицин (Gibco, номер по каталогу 043-5600D) и ти-лозин (Flow Laboratories, номер по каталогу 16-722-48). Оба антибиотика использовали в максимально допустимых для
19*
292 Глава 17
клеток концентрациях (25—50 мкг/мл). В клонах, полученных из таких культур, микоплазма не обнаруживалась в течение
4 мес.
3. Замораживание клонов ЦТЛ
Большинство клонов ЦТЛ и гибридомы очень хорошо выдерживают замораживание и оттаивание. Однако некоторые клоны ЦТЛ третьего типа (разд. IV, Б, 3) плохо переносят эти процедуры. В настоящее время мы постоянно используем в нашей лаборатории метод, предложенный Лейбо и Мазуром (Lei-bo, Mazur, 1978) для замораживания Т-клеточных линий. Вскоре после повторного клонирования и функционального анализа клоны размножают в больших бутылях (Falcon 3013F), клетки собирают и суспендируют в CS-среде в концентрации 5-107 клеток/мл. Вносят 100 мкл суспензии (5-106 клеток) в пластиковые пробирки на 2 мл с завинчивающимися крышками (ST 506, Ste-rilin IG, Zurich, Швейцария), которые предварительно стерилизуют нагреванием до 140 °С в течение 40 мин. До добавления холодного СР с 28,4% ДМСО пробирки оставляют во льду. Затем пробирки погружают в предварительно охлажденный этанол и продолжают охлаждение, понижая температуру на 1 °С в 2 мин, используя охлаждающую камеру (Multi-Cool FTS-Sys-tems, Inc.). В интервале от —6 до —10°С индуцируют образование льда в пробирке. С этой целью обхватывают пробирку пинцетом (предварительно охлажденным в жидком азоте) до тех пор, пока не убеждаются, что внутри пробирки действительно образуется лед. Затем пробы немедленно вновь погружают в этанол на 1—2 с и при температуре —60 °С переносят в жидкий азот.
Для размораживания пробы переносят в стаканы, предварительно охлажденные в жидком азоте, и оставляют нагреваться на воздухе. Через 15—20 мин пробы почти полностью оттаивают, и их переносят в ледяную воду. Полностью размороженные пробы переносят в водяную баню при 37 °С и добавляют к ним подогретую до 30 °С CS-среду в соответствии со следующей схемой: 5 раз по 20 мкл, 6 раз по 50 мкл, 4 раза по 100 мкл и 2 раза по 500 мкл через 2—3 мин. После каждой добавки пробы тщательно перемешивают. Клеточную суспензию объединяют с 20 мл теплой CS-среды и разливают по лункам панелей Costar 3524. В каждую из 10 лунок наливают по 2 мл клеточной суспензии (2,5-105 исходно замороженных клеток) и по 100 мкл CS-среды, содержащей 2-105 облученных (2000 Р) перитонеальных клеток. Некоторые клоны размножаются достаточно интенсивно, и через 2—3 сут рост клеток становится
Цитолитические Т-клеточные клоны и гибридомы
293
заметным во всех лунках. Рост других клонов восстановить труднее: у них размножение клеток наблюдается только через 5—10 дней и только в некоторых лунках.
IV. ПРИМЕНЕНИЕ
А. Отбор антиген-специфических цитолитических Т-клеток in vitro
В смешанной культуре лейкоцитов стимуляции подвергается гетерогенная популяция клеток. Помимо ЦТЛ индуцируются Т-хелперные клетки и происходит образование факторов, которые могут активировать и (или) вызывать размножение так называемых В- и Т-клеток-«свидетелей» (von Boehmer, 1974). Несмотря на это, при стимуляции клеток иммунизированных или интактных животных облученными клетками селезенки, которые экспрессируют соответствующий антиген, удается получить существенное обогащение популяции антиген-специфическими Т-клетками. Мы обнаружили, что приблизительно 20—30% Т-клеточных клонов, выделенных через 10—12 сут после стимуляции in vitro (при эффективности клонирования 10—12%),обладают специфичностью в отношении антигенов клеток-стимуляторов.
