Физические методы исследования белков и нуклеиновых кислот - Лазуркина Ю.С.
Скачать (прямая ссылка):
При относительно небольших центробежных ускорениях поток седиментирующего вещества оказывается сравнимым по величине с потоком вещества в противоположную сторону, вызванным диффузией, так что граница между раствором и растворителем не образуется, а происходит лишь некоторое перераспределение концентрации в кювете. Очевидно, концентрация исследуемого вещества в верхней, обращенной к оси вращения части кюветы меньше, чем концентрация в 'исходном растворе. Ближе ко дну кюветы концентрация, наоборот, возрастает, превышая исходную. При достаточно длительном времени центрифугирования устанавливается равновесие потоков вещества в каждой точке и образуется равновесное распределение вещества по длине кюветы. По форме установившегося распределения можно судйть о свойствах исследуемых частиц, в частности об их молекулярном весе [26, 27].
Те же самые сведения, но с несколько меньшей точностью, можно получить, анализируя распределение концентрации в кювете в начальной стадии установления равновесия. Этот метод, называемый методом приближения к равновесию (метод Арчи-
бальда (28]), широко применяется в практике. К методу седимен-тационного равновесия можно также отнести 'метод равновесного ультрацентрифугирования в градиенте плотности. При длительном ультрацентрифугировании концентрированных раство-ро.в низкомолекулярных солей (таких, как CsCl, CS2SO4, ацетат цезия, RbBr, КВг и др.) возникает градиент плотности за счет перераспределения концентрации солевого раствора. Макромолекулы, находящиеся в таком растворе, через некоторое время располагаются в узкой зоне, где локальная плотность растворителя соответствует плотности этих макромолекул. Этот метод позволяет проводить фракционирование макромолекул по их плотности, оценить гетерогенность изучаемого образца по плотности, а также его молекулярный вес [29].
Уже это краткое перечисление хорошо демонстрирует гибкость (Метода ультрацентрифугирования и его широкие возможности .в исследовании макромолекул.
а. Краткие сведения об аналитических ультрацентрифугах
Центробежные ускорения, создаваемые в современных ультрацентрифугах, достигают 300 000 g, где g — величина ускорения силы тяжести. Роторы, способные выдержать такие ускорения, делаются из особо прочных сплавов алюминия или титана и имеют специальную форму.
Вращение ротора может осуществляться либо масляной тур-бинкой [26], либо воздушной (современные ультраценприфуги; Five, ФРГ; Г-120, Венгрия), либо электромотором (например, модели «Spinco», США; UCA, Япония; УЦА-4, СССР). Последнему типу привода в настоящее время отдают 'предпочтение ввиду его явных преимуществ — малогабаритное™, отсутствия громоздких вспомогательных узлов, поэтому приводимые ниже характеристики будут относиться к ультрацентрифугам подобного типа, т. е. «Spinco», UCA и УЦА-4. Передача вращения ротору в ультрацентрифугах с электрическим приводом осуществляется через гибкий вал-струну, на которой подвешивается ротор. Такая подвеска ротора обеспечивает самобалансирование его при вращении и допускает менее тщательное уравновешивание при заполнении кювет или пробирок. Ротор вращается в камере с глубоким вакуумом (10~3—>10~4 мм рт. ст.), что необходимо для предотвращения разогрева ротора из-за трения в воздушной среде, так как 'при проведении аналитических опытов предъявляются очень жесткие требования к стабильности температуры. Вакуумная камера окружена броневой защитой на случай разрыва ротора. Стабильность вращения ротора при низких скоростях (2000—2500 об/мин) в ультрацентрифугах типа Spinco Е, UCA составляет 0,5-н0,3% от заданной скорости, а при максимальной скорости достигает 0,1%.
П процессе ритмы геМпература ротора измеряется и поддерживается постоянной. Ее измерение производится либо при помощи термопары, расположенной в вакуумной камере вблизи ротора, либо при помощи термомагнитных колец, расположенных на роторе (ультрацентрифуга UCA, Япония), или запрессованным в тело ротора термистором — по изменению его сопротивления (наиболее современный метод). Термистор является составной частью электронной схемы, автоматически поддерживающей заданную температуру посредством постоянно действующего холодильника, укрепленного на внутренней стенке вакуумной камеры, и расположенного под ротором электрического нагревателя, включаемого автоматически ino мере надобности. Ко.нтакт термистора с устройством, обеспечивающим автоматическое включение нагревателя, осуществляется через иглу, укрепленную по оси внизу ротора и погруженную в неподвижную чашечку с ртутью. Рабочий диапазон температур в ультрацентрифугах обычно составляет 0—35°, а при наличии специальной приставки—до 120°. Температура поддерживается с точностью ~0,1° и измеряется с точностью ^0,02°.
Ультрацентрифуги снабжаются разнообразными роторами, отличающимися размерами, количеством и емкостью пробирок и максимально допустимой для данного ротора скоростью вращения. Имеются три основных типа роторов: угловой для проведения препаративных работ, ротор с откидными стаканами для проведения аналитических и препаративных работ и аналитический ротор. Препаративные угловые роторы выпускаются в очень широком ассортименте, перечислять который здесь нет надобности. Роторы с откидными стаканами в иностранной литературе (называются bucket-rotor, или swing-out-rotor. Стаканы имеют специальные герметизирующие пробки, предотвращающие испарение раствора из пробирок в вакуумной камере. В настоящее время доступны роторы с откидными стаканами для пробирок емкостью 5 млу рассчитанные на максимальную скорость — 65 ООО об,)мин (максимальное ускорение — 350 ООО g), и с пробирками емкостью 34 и 60 мл — максимальная скорость 25 000 об/мин (максимальное ускорение 90 000 g). Такие роторы изготовляются как иностранными фирмами (США, Япония), так и в СССР (СКВ БФЭМ).
